3生物发光是由荧光素酶与荧光素.ppt

生物发光的原理及其应用bioluminescence ; 每当夜幕降临时，无数发光的浮游动物聚集，使海面出现红色闪光，犹如万家灯火，形成海上奇观。 生物发光是一种普遍的自然现象，在海洋生物中尤为常见。 ; 生物体发出的光辐射。它不依赖于有机体对光的吸收，而是一种特殊类型的生物化学发光。 ;目前，根据发光的机理不同国际上将生物发光分为四种：;四种发光：;3. 化学发光化学发光是在化学反应过程中(主要为氧化还原反应)发出可见光的现象。化学发光反应是由两个关键步骤组成：激发和发射。许多化学反应进行时能释放足够的自由能而把参加反应的物质之一激发到能发射光的电子激发态，生成一种激发态产物，在它回到基态时，剩余能量转变成光子能量产生发光现象。 ;4. 生物超微弱发光随着生物发光研究的进一步深入，发现人体的器官、组织、细胞、乃至大分子都在发光，不过发光强度更弱。目前研究已涉及到细胞、亚细胞乃至生物大分子的层次。越来越多的实验表明，DNA 是生物超微弱发光的一个辐射源。;生物发光可分为: 被动发光：如植物，那些微弱的红光是没能参与光合作用多余的光，一般的看法是这种光无意义。 主动发光：如萤火虫的闪光。 另外，有些动物本身并不会发光，但在共生的环境中它们会利用发光细菌的光为自己服务。;动物的发光器有两类，一类具有发光细胞，另一类具有共生的发光细菌。;生物发光的一般机制是：  荧光素酶（Luciferase）以荧光素（Luciferin）、三磷酸腺苷（ATP）和O2为底物，在Mg2＋存在时，底物在催化循环中会形成还原型核黄素磷酸盐和醛化合物，当遇到荧光素酶和氧时，形成一种激发的络合物。络合物断裂时生成氧化核黄素磷酸盐、酸、水及一个光子，化学能转变为光能。;荧光素+ ATP+ O2→核黄素磷酸盐+醛化合物核黄素磷酸盐+醛化合物→激发的络合物激发的络合物→氧化核黄素磷酸盐+酸+水+光子化学能→光能; ATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又是所有生物生??活动的能量来源。在荧光素酶催化的发光反应中，ATP在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线性关系。;研究发现生物发光有以下几个特点： ;生物发光的应用;2 利用生物发光蛋白测定细胞内游离Ca2+   Ca2+对细胞的代谢与功能的调节作用几乎涉及到细胞的所有生理和生化过程。细胞内游离Ca2+浓度及其分布的变化代表着某种细胞功能的启动、加强和抑制，是形成Ca2+信号的基础。研究Ca2+与细胞功能的关系具有十分重要的意义。利用光蛋白与Ca2+反应极其灵敏的特性，可以测出微量Ca2+的含量。 1967年，Ridgway和Ashley用从水母(acguoreaforskalea)中分离出的一种蛋白质—水母发光蛋白(acguorin)，第一次成功地测定了活细胞内[Ca2+]。水母蛋白与Ca2+结合后激活而发出蓝色荧光(465mm)，在0.1一10μmol/L Ca2+范围内荧光强度与[Ca2+]成正相关，是目前应用最广的一种Ca2+生物发光指示剂。 Ca2+生物发光指示剂不受光漂白效应的影响，对细胞无毒性. ;有几个不足之处： ;3 应用在免疫检测中进行标记物的超灵敏检测。BL反应已经被证明是检测酶标记的极为灵敏的方法，依赖于萤火虫荧光素酶热稳定突变体标记的醋酸激酶BL检测可以得到极低的检测极限(8.5x10-23?mol) ;4． 微孔板上的生物发光(BL) 基于超灵敏的光电耦荷装置（CCD）的成像系统，可以同时测量整个384孔板的BL信号。其中每个孔的信号都会通过对BL数字图象进行软件分析得到精确的定量。通过对直观可视信号的评估，测量得到的BL光信号会被转变成假色，而更加突出不同的光强度，如图所显示。 ;5 酶抑制剂筛选一种BL检测方法可以用来检测蛋白酶活性。水母融合蛋白(配合一个最优的自然蛋白酶酶切位点)被固化在微孔板空内，作为HIV-1蛋白酶的底物。蛋白酶水解键后从固态上释放出水母蛋白，从而增加了BL信号。这个系统可以通过在BL融合蛋白中引入特定的酶切位点而针对不同蛋白酶进行抑制剂筛选。;6．活体动物成像????BL反应所产生的可见光可以部分的透过动物组织，因此可以在整体动物的模式下进行成像。BL全体细胞和分子成像作为一种灵敏、可定量、非侵入性的和实时的方法，可以用来对活体动物进行生物学研究，并将对生物技术、分子医学、基因治疗和药物研发等领域产生深远的影响。? ;7．体内基因表达 　　 体内基因表达模式方面的研究。在药物研发领域，科学