Na2CO3胁迫对星星草幼苗叶绿体GST活性的影响-扬州大学.doc

PAGE  PAGE 9 Na2CO3胁迫对星星草幼苗叶绿体GST活性的影响 姓名:汪月霞 学好:03238 指导教师：孙国荣 扬州大学农学院，扬州225009 土壤盐碱化已成为世界农业生产面临的主要威胁之一。全世界约有57亿亩土地具有不同程度的盐碱化[1，2]，我国15亿亩耕地中就有1亿多亩盐碱地，此外还有5亿多亩的盐碱荒地[3]。由于气候干旱、过度放牧与不合理利用等原因，造成土壤盐渍化程度加重，碱斑面积逐年扩大，草地生产力严重下降。治理碱斑，改良碱化草地，开发利用盐碱土地资源已是迫在眉睫。改良利用盐碱地的途径有很多，现在普遍认为筛选利用耐盐植物种和品种的生物措施是比较经济有效的方法。星星草是一种耐盐碱性较强的禾本科牧草，今年来被筛选经人工种植用于改良碱化草地效果良好，在黑龙江等地有一定面积的应用[4，5]，但有关星星草在盐碱胁迫下的反应和星星草对盐碱胁迫的抗性甚少。一般认为禾本科牧草在发芽期和苗期对盐份最为敏感[6，7]，而且有关研究较多[6，7，8，9，10]。但这些研究多是以中性盐NaCl作为胁迫处理的，对碱性盐涉及甚少，而星星草应用最多的松嫩草地的盐碱土就是以Na2CO3和NaHCO3为主要成分的[11]。谷胱甘肽转移酶（GST）家族是自然界的各种生物在长期进化过程中形成的一套代谢毒性物质的解毒酶系统的重要组成部分之一。GST专一催化谷胱甘肽（GSH）巯基与其他化合物的亲电基团作用[12，13]， 生成谷胱甘肽衍生物，具有降低化学反应活性的效应[14]， 就其解毒功能而言，概括地说，主要有两点：一是对有机氢过氧化物的还原，二是对活性亲电子剂的灭活（活性亲电子剂具有很强的攻击亲核中心的能力，它们与细胞内DNA等大分子共价结合可导致细胞突变或癌变等严重后果）。GSH是存在于细胞液中的含-SH基的非蛋白分子。在GST的催化下很容易与这些亲电子剂螯合。有些活性很高的亲电子剂可以直接与GSH螯合而不需要GST的催化。亲电子剂与GSH螯合后便被灭活。现已证实GST广泛存在于细菌、真菌、动物和植物体内[15]。除草剂及其类似物、机械损伤、氧化胁迫、高温等外界逆境可以诱导GST的合成[16]。因此我们以星星草幼苗为原料，用碱性盐溶液处理，通过不同浓度Na2CO3胁迫下星星草幼苗培养基质和叶片渗透势、叶片相对电导率、叶绿体GST活性和O2-产生速率的测定，以探讨不同浓度Na2CO3胁迫对星星草幼苗叶绿体GST活性的影响，在细胞水平揭示星星草幼苗抗盐碱的生理机制。 1.材料与方法 1．1 实验材料 星星草种子由大庆市畜牧局草原站提供。 1．2 材料培养 用容积为600ml的塑料盆装满珍珠岩，加住Hoagland培养液至珍珠岩表面湿润，然后将星星草种子均匀撒在其上，正常室温培养。 1. 3 材料处理 待幼苗长到二叶期以上（50d）进行盐胁迫处理。将幼苗随机分成6组（每组2个平行样），根据塑料盆所盛溶液数量（600ml）计算所需母液数量（10% Na2CO3），用漏斗加至珍珠岩底层，并补充相应数量的Hoagland营养液达到原湿润程度，使6组塑料盆中Na2CO3浓度分别为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0g·100mL-1。 1．4 测定方法 1．4．1 培养基质和叶片渗透势的测定 在盐胁迫处理7d后，采用5520型蒸压计渗压计（Hansatech公司）来测定培养基质和星星草叶片的渗透势。培养基质渗透势与Na2CO3浓度呈显著非线性关系（Y=-1.9588-4.3607X-0.0258X2，P=0.0021）（图1）。 1．4．2 叶绿体的分离与纯化 称取叶子5g，放入预先冷冻的研钵中（加入液氮），加入20ml的pH7.5研磨液（包含0.4 molL-1蔗糖，50m molL-1磷酸缓冲液，10m molL-1KCl，10m molL-1MgCl2，10m molL-1EDTA，10m molL-1DTT），快速研磨；然后通过4层纱布过滤，并且在1000r下离心5min，弃沉淀； 滤液在3000r下离心5min，弃上清；沉淀被轻轻悬浮在5ml的悬浮介质中 ，并在3000r下离心5min，弃上清，沉淀即为叶绿体[17]。 1．4．3 粗酶液的制备 叶绿体用悬浮液洗2次后被悬浮在5ml的pH7.2悬浮液（包含0.4 molL-1蔗糖，2.5m molL-1pH7.2磷酸缓冲液，10m molL-1EDTA，10m molL-1DTT）中，然后加入0.05%Triton-100并于15000r离心10min去除不溶物质，上清即为粗酶液[17]。 1．4．4 粗酶液蛋白质含量的测定 参照刘祖琪的方法（1994）[18]，叶绿体酶液100ul，加入80ul0.15 molL-1 NaCl溶液和5ml蛋白质测定试剂，摇匀