大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因真核表达载体的构建及其在MKN45细胞中的表达.docVIP

　　大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因真核表达载体的构建及其在MKN45细胞中的表达 【关键词】 大肠杆菌 　　Construction of Eukaryotic Expression Vector Containing E.coli Purine Nucleoside Phosphorylase and Its Expression in MKN45 Cells 　　Abstract：Objective To clone E.coli PNP gene, construct its eukaryotic expression vector and obtain positive MKN45 cell clones expressing E.coli PNP gene stably. Methods PCR amplification ed using primers based on E.coli PNP gene sequence from Genbank, E.coli genomic DNA as template .PCR product ed, the gene id in method. Results PCR yielded a fragment of 716bp and EPNP e digestion analysis shoounts of EPNP mRNA and shoid containing E.coli PNP gene . 　　Key RNA，前体药MePdR对转染EPNP的MKN45细胞有较强的细胞毒作用。结论 成功构建了大肠杆菌PNP基因的真核表达载体, 获得了稳定表达大肠杆菌PNP基因的MKN45细胞克隆,为PNP/MepdR自杀基因系统在胃癌基因 治疗 中的 应用 奠定了良好的基础。 ??　关键词：大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶;自杀基因；基因治疗 　　0 引言 　　随着 现代 生物技术的 发展 , 基因治疗已成为继肿瘤的手术治疗和放疗、化疗后的又一新途径。特别是自杀基因治疗为 目前 国内外 研究 的热点之一。大肠杆菌DeoD基因编码的嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）能将无毒的前体药脱氧腺苷类似物分解产生剧毒的腺嘌呤类似物, 通过抑制DNA、RNA和蛋白质的合成,而引起细胞死亡。同时它能够通过产生极强的旁观者效应,不仅使转基因细胞被杀死,而且大量未转基因的细胞亦被杀死[1,2]。本文对大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(EPNP)基因进行分子克隆并构建到pcDNA3.1真核表达载体中, 并获得稳定表达EPNP基因的MKN45细胞克隆,为今后进一步研究自杀基因在胃癌基因治疗中的应用创造条件。 　　1 材料和方法 　　1.1 载体与菌株 大肠杆菌JM109和真核表达载体pcDNA3.1均购自Invitrogen公司。克隆载体pMD18T购自大连宝生物公司。 　　1.2 主要试剂 限制性内切酶Bam HI 和Hind III、T4DNA链接酶和TaqDNA聚合酶、DL2000 Marker均购自大连宝生物公司；凝胶DNA提取Kit和PCR产物纯化Kit购自Promega公司；LipofectaminTM Reagent、Geicin(G418 Sulfate) 及MePdR为Invitrogen公司产品；IPTG和Xgal购自上海生物工程公司。实验所用试剂均为进口或国产 分析 纯试剂。 　　1.3 目的基因的克隆 ①引物设计: 根据GenBank数据库提供的EPNP基因的核苷酸序列设计一对引物。为方便克隆,在上游引物和下游引物的5′端分别引入Hind III 和Bam HI 酶切位点。上游引物：5’ –ATCATAAGCTTATGGCTACCCCACACATTAATG3’下游引物：5ATATGGATCCTTACTCTTTATCGCCCAG3’②模板提取: 大肠杆菌JM109基因组DNA的提取,按 　　1.7 RTPCR 鉴定EPNP基因在MKN45细胞中的稳定表达 待具有Ｇ418抗性的MKN45细胞克隆长满6孔板时,抽提转染pcDNA3.1EPNP细胞(MKN45/pcDNA3.1EPNP)和转染空载体pcDNA3.1细胞(MKN45/pcDNA3.1)总RNA, 进行RTPCR反应, 鉴定EPNP和内参照GAPDH mRNA的表达。 　　1.8 MTT法检测MePdR对转染ECPNP细胞的细胞毒作用 转染pcDNA3.1EPNP细胞、转染空载体pcDNA3.1细胞和亲本细胞以1×104/孔接种于96孔板，24h后加入不同浓度的MePdR使终浓度分别为107、2.5×107、5×107、106、105mol/L，以不加药的未转染细胞作对照。每实验组设3个复孔，培