大肠癌转移淋巴结构建人源性抗大肠癌噬菌体Fab抗体库.docVIP

　　大肠癌转移淋巴结构建人源性抗大肠癌噬菌体Fab抗体库 作者：刘锐 孙立娟 何成彦 周劲松 【摘要】 目的 构建人源性抗大肠癌噬菌体Fab抗体库。方法 术中剥取老年大肠癌患者系膜内转移淋巴结，提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，进行PCR，克隆于pb3 载体,再经电转化大肠杆菌XLIBlue菌株,形成噬菌体抗体库，最后通过免疫印记法鉴定初级抗体库中噬菌体上有Fab段的表达。结果 从系膜内转移淋巴结中扩增出650 bp重链Fd和轻链基因产物，轻链基因产物插入测得转化菌数为4.7×106，鉴定插入率为70%；重链Fd基因产物测得转化菌数为3.5×106，插入率为60%；免疫印迹法鉴定成功建立噬菌体Fab抗体库，库容量达1.4×106。结论 筛选大肠癌特异性抗原和相应噬菌体抗体，对大肠癌发病机制的研究以及探讨早期诊断方法有重要意义。 【关键词】 大肠癌；噬菌体；抗体 　　目前所知的与大肠癌相关的抗体不仅??限，而且特异性不高，因此寻找大肠癌相关特异性抗原以及高特异性、高亲和性抗体一直备受学者关注。抗体技术已 发展 到基因工程阶段，人源性基因工程抗体异源性弱，利用抗体工程技术可提高其亲和力，延长半衰期。用PCR技术克隆抗体可变区基因和在大肠杆菌中表达有抗体活性的免疫球蛋白分子片段，是基因工程抗体技术的两个关键基础条件。噬菌体抗体库技术就是在此基础上发展起来并得到应用。目前国内外已有学者开展了大肠癌抗体库的研究，并建立了相应库容的大肠癌噬菌体抗体库〔1，2〕。本研究首先从大肠癌患者转移的淋巴结构建人源性抗大肠癌噬菌体Fab抗体库，并为进一步研究工作奠定基础。 　　1 资料与方法 　　1.1 病例选择 　　随机选取5例于我院行大肠腺癌（C期2例，D期3例）根治术的患者，年龄均＞60岁,术中剥取系膜内转移淋巴结3～5枚，共18枚（直径均1 cm以上，将所取淋巴结剖为两半，一半留作建库用，一半送检病理），切取大肠癌组织及正常大肠黏膜层组织各1 g左右。术后这5例患者的切除标本均经病理诊断证实为大肠腺癌，所取18枚淋巴结中，14枚病理诊断证实为转移淋巴结。切取大肠癌组织及正常大肠黏膜层组织各1 g左右。随即置液氮中保存备用。 　　1.2 载体、菌株和辅助噬菌体 　　采用噬菌体载体pb3,由The Scripps Research Institute提供，含质粒CO1E1的起始位点、F1噬菌体的复制起始位点及氨苄青霉素（Amp）抗性基因；轻链及重链Fd的表达均受Lacz启动子控制。整个载体大小4 890 bp。宿主菌采用大肠杆菌XLIBlue,由The Scripps Research Institute提供,基因型Tn10上带有四环素（Tet）抗性基因。辅助噬菌体采用VCSM13，由The Scripps Research Institute提供，含卡那霉素（Kan）抗性基因，滴度1 012 pfu/ml。自行培养扩增后4℃保存。 　　1.3 主要试剂 　　RTPCR和PCR试剂盒购自Promega，限制性内切酶和连接酶购自 Promega。RTPCR和PCR引物参照The Scripps Research Institute提供的引物组设计,由上海基康生物技术公司合成。其他化学分析试剂、细菌培养平皿等为国产。 　　1.4 淋巴细胞的分离纯化、细胞总RNA的提取（Trizol法）、cDNA的合成（Gibco BRL法） 均按试剂盒说明进行。 　　1.5 PCR扩增Fab抗体基因 　　1.5.1 引物序列 　　见表1。表1 引物序列（略） 　　1.5.2 PCR扩增Fd及轻链基因 　　(1)在250 μl薄壁PCR反应Eppendorf管中加入：cDNA 2 μl;5′端引物（60 pmol/L）1 μl; 3′端引物（60 pmol/L）1 μl;去离子水71 μl 置94℃ 4～5 min后，立即置于冰上，瞬时离心，在管中加入：10×PCR缓冲液10 μl;25 mmol/L MgCl2 6 μl;10 mmol/L dNTPs 8 μl;Taq酶(5 U/μl)0.5～1 μl，瞬时离心后，加入1～2滴液体石蜡。(2)反应条件：94℃，1 min；52℃，1 min；72℃，2 min。35个循环，72℃延伸10 min，置于4℃。(3)每个反应管中各取5 μl PCR反应物，加入适量TAE缓冲液及DNA凝胶电泳加样缓冲液，在0.8%～1%琼脂糖凝胶中电泳。 　　1.6 PCR产物的纯化（spinX纯化方法）。 　　1.7 Fd和轻链基因的克隆及噬菌体抗体库的建立 　　1.7.1 噬菌体载体pb3 DNA的制备 　　将pb3载体DNA转化XLIBlu感受态菌，挑取单个菌落接种入30～40 ml SBA