大鼠皮层星形胶质细胞原代培养、鉴定及氧糖剥夺模型的建立.docVIP

　　大鼠皮层星形胶质细胞原代培养、鉴定及氧糖剥夺模型的建立 作者：魏爱宣 李昕华 闫世军 何金婷 莽靖 邢影 邵延坤 徐忠信 【摘要】 目的 原代培养和鉴定大鼠皮层星形胶质细胞，并建立大鼠皮层星形胶质细胞氧糖剥夺(OGD)模型。方法 大鼠星形胶质细胞原代培养后，作胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色鉴定，应用缺氧DHank液及缺氧培养罐行OGD后用台盼蓝染色及乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测细胞损伤程度。结果 星形胶质细胞培养至第9天， GFAP染色阳性细胞为98.54%±2.01%;星形胶质细胞经不同时间OGD处理后，台盼蓝染色呈现不同形态;OGD60 min时，星形胶质细胞LDH漏出率较对照组明显增加(Plt;0.05)，并随时间递增。结论 成功完成大鼠皮层星形胶质细胞原代培养，星形胶质细胞在培养第9天可用于模型制备，成功建立星形胶质细胞OGD模型。 【关键词】 星形胶质细胞;原代培养;氧糖剥夺(OGD) 　　【Abstract】 Objective To conduct primary culture and identification of rat cerebral cortical astrocytes, and to set up the oxygen/glucose deprivation (OGD) model. Methods Cells presented in the culture munocytochemistry, using specific antiGFAP antibody. OGD model ber and identified by cell death and LDH release rate. Results Immunohistochemistry of cultured cell shootility identified by trypanblue stain e; 60 min OGD caused a significant increase on the levels of LDH release (Plt;0.05). Conclusions The primary culture astrocytes could be explored to OGD at the 9th day. The model of OGD ischemia in astrocytes is successfully established by hypoxic DHank′s and an anaerobic chamber. 　　【Key ary culture; Oxygen glucose deprivation (OGD) 　　研究表明在缺血缺氧性脑损伤过程中，星形胶质细胞和神经元有着动态、复杂的相互作用，从而维持脑组织的正常功能和存活〔1～3〕。本实验采用大鼠皮层星形胶质细胞原代培养，应用体外氧糖剥夺(oxygenglucose deprivation, OGD)建立大鼠脑皮层星形胶质细胞缺血缺氧损伤模型，模拟体内脑缺血过程，为今后进一步探讨缺血过程中星形胶质细胞的脑保护作用机制奠定基础。 　 　1 材料与方法 　　1.1 实验动物 出生1～2 d内的m3的小块，移入无菌锥底离心管内，加入胰酶，形成细胞悬液;于37℃，5% CO2培养箱中孵育、培养、传代备用。 　　1.3 大鼠皮层星形胶质细胞鉴定 ①细胞培养板每日置于倒置显微镜下观察细胞胞体与突起形态、贴壁与生长情况。②星形胶质细胞在培养第9天用胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protEin, GFAP)免疫细胞化学染色进行鉴定，显微镜下观察，以在细胞膜和胞浆内出现棕黄色颗粒者判定为阳性，每张爬片随机选取3个200×视野，计数，取均值， 计算 阳性细胞百分比。 　　1.4 体外培养星形胶质细胞OGD模型的建立 ①利用自行设计、长春应用化学研究所生产的组装瓶和负压吸引装置将DHank液通入含95%N2及5%CO2的缺氧气体，制备缺氧DHank液，用血气分析仪测定缺氧DHank液的氧浓度。②将真空干燥器通入缺氧气体制成缺氧罐，用麻醉气体分析仪测定缺氧罐内氧含量。③将培养第9天的星形胶质细胞用缺氧DHank液孵育，并放入缺氧罐中，将缺氧罐放入37℃孵箱内开始计时;分别取缺氧时间为15、30、45、60、90、120、180 min再复氧24 h的星形胶质细胞进行评价。 　　1.5 体外培养星形胶质细胞OGD模型的评价 ①台盼蓝染色法测定细胞死亡率。测定时取出培养板，每个时间点取3孔，吸弃上清液，然后加一滴 0.4%台盼蓝溶液，在3 min内随机计数200