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十二、缓解体力疲劳功能检验方法 Metbod for tbe Assessment of Alleviating Pbysical Fatigue Function 动物实验 1　负重游泳实验 1.1　检验原理 运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最直接的表现，游泳时间的长短可以反应动物运动疲劳的程度。 1.2　仪器与器材 游泳箱（大小约50cm×50cm×40cm），电子天平、铅皮。 1.3　实验方法 1.3.1　实验动物　　推荐使用纯系小鼠，成年小鼠，体重18－22g，。 1.3.2　剂量分组及受试样品给予时间 实验设三个剂量组和一个空白对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。 1.3.3　实验步骤 末次给予受试样品30min后（酒类样品测试当天可以不灌胃），置小鼠在游泳箱中游泳。水深不少于30cm，水温25℃±1.0℃，鼠尾根部负荷5％体重的铅皮。记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，作为小鼠游泳时间。 1.4　数据处理及结果判定 游泳时间为计量资料，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。 若受试样品组游泳时间明显长于对照组，且差异有显著性，可判定该实验结果阳性。 1.5　注意事项 1.5.1　每一游泳箱一次放入的小鼠不宜太多，否则互相挤靠，影响实验结果。 1.5.2　水温对小鼠的游泳时间有明显的影响，因此要求各组水温控制一致，每一批小鼠下水之前都应测量水温，水温以25℃为宜，如果过低可能引起小鼠痉挛，影响实验结果，过高（30℃）则游泳时间太长不便于操作。 1.5.3　铅皮缠绕松紧应适宜。 1.5.4　观察者应在整个实验过程中使每只小鼠四肢保持运动。如果小鼠漂浮在水面四肢不动，可用木棒在其附近搅动。 1.5.5　不同批的小鼠因饲养环境、季节等原因的变化体质上会出现差异。因此受试样品组和对照组应采用同一批动物同时进行实验?? 　 2　血清尿素测定 全自动生化仪测定和二乙酰—肟法任选一种。 2.1　全自动生化仪测定：按有关仪器说明书和试剂盒操作。 2.2　二乙酰—肟法 2.2.1原理 样品中尿素在氯化高铁—磷酸溶液中与二乙酰—肟和硫氨脲共煮，形成一种红色的化合物Diazine，其颜色的深浅与尿素含量成正比。与同样处理的尿素标准管比较，可求出尿素的含量。 2.2.2　仪器和试剂 2.2.2.1　721分光光度计，10mL　带塞试管，1mL（或1.5mL）塑料离心管，电炉，锅，灌胃针头。 2.2.2.2　尿素试剂盒（二乙酰－肟法）：二乙酰-肟应用液、氯化铁－磷酸应用液、尿素标准液（200　mg/L）。 2.2.2.3　若无试剂盒，可自行配制试剂。试剂配制方法如下： 1g/L　二乙酰—肟溶液：取二乙酰—肟1.0g，氨基硫脲（thiosemicarbazide）0.2g，氯化钠4.5g，溶于蒸馏水并加至1000mL。 33g/L　三氯化铁溶液：取三氯化铁1.0g溶于浓磷酸20mL　中，加蒸馏水10mL，摇匀。 酸溶液：取蒸馏水800mL，慢慢加入浓硫酸50mL，边加边摇；再加入85％磷酸50mL，摇匀。加入33g/L　三氯化铁溶液1.5mL，加水至1L。 10　m　mol/L　尿素标准液（尿素28.01mg/dL）：精确称取尿素（AR）150.3mg　溶于16　m　mol/L　苯甲酸溶液并加至250mL。 16　m　mol/L　苯甲酸液：取苯甲酸2.0g　溶于蒸馏水1000mL　中，加浓硫酸0.8mL。 2.2.3 实验方法 2.2.3.1 实验动物? 成年小鼠或大鼠，小鼠体重18-22g，Wistar 或SD大鼠体重160-200g。推荐使用雄性小鼠。 2.2.3.2 剂量设计和分组? 大鼠以人体推荐量的5倍为基本剂量。其余同1.1.3.2。 2.2.3.3 实验步骤 2.2.3.3.1 高尿素模型的建立及标本制备：末次给受试样品30min 后，在温度为30℃的水中不负重游泳90min ，休息60min后采血。大鼠采尾血，小鼠拔眼球采全血约0.5mL（不加抗凝剂）。置4℃冰箱约3h,血凝固后2000prn/min离心15min,取血清备用。血清中的尿素在室温下可稳定24h，在4-6℃可稳定7天以上。用二乙酰-肟法测定。 2.2.3.3.2 试剂盒操作步骤（本推荐使用的试剂盒适用于手工操作） ?测定管标准管空白管尿素标准液（mL）