1992培养条件对重组大肠杆菌生长及外源蛋白基因表达的影响要点.doc

培养条件对重组大肠杆菌生长及外源蛋白基因表达的影响 方宏清 于公义 (军事医学科学院生物工程研究所,北京,100071) 摘 要 综述了培养基、温度、pH、溶氧、比生长速率等对重组大肠杆菌生长、外源蛋白基因表达及产物存在形式的影响，并探讨了提高表达水平的途径。 关键词 重组大肠杆菌；培养条件；外源蛋白基因表达；存在形式 重组DNA技术发展至今,已有许多外源蛋白基因在大肠杆菌中获得表达,其中一些蛋白产品已投放市场。这些产品能够进行大规模生产在很大程度上得益于发酵培养技术的完善。与传统发酵培养相比,重组菌培养有其自身的特点,即:产物(蛋白质)为初级代谢产物;目的基因克隆在质粒上,存在结构不稳定性和分配不稳定性;随着培养条件的改变,基因剂量可以发生质的和量的变化;大多数克隆基因的表达是由已知的诱导型启动子控制,因此可根据启动子的特性实施先高密度培养后高表达的策略。重组大肠杆菌的产物可分为菌体产品(死菌)、胞质产品(包含体或可溶形式)、周质产品和胞外产品。表1列出了重组大肠杆菌的产物特点及常用启动子。本文综述了培养基、温度、PH、溶氧、比生长速率等对重组大肠杆菌生长、外源蛋白基因表达及产物存在形式的影响,并探讨了提高表达水平的途径。 1重组大肠杆菌生长及外源蛋白合成的一般影响因素 1.1 培养基 培养基是影响菌体生长及产物合成的主要因素之一,基本组成包括碳源、氮源、无机盐、微量元素、维生素和生物素等,对营养缺陷型菌还应考虑补加相应的营养成分。应用正交设计及均匀设计等数学工具优化培养基成分及配比是提高外源蛋白产量的重要手段。 不同的碳源对菌体生长的影响不同。Anderson等[1] 研究了不同碳源对野生型大肠杆菌生长的影响。结果表明,在基础培养基中,葡萄糖和甘油相比,它们所导致的菌体比生长速率及呼吸强度相差不大,但甘油的菌体得率较大,而葡萄糖所产生的副产物较多;用甘露糖作碳源时,不产生乙酸,但比生长速率和呼吸强度均较小。碳源对基因表达也有不同的影响,主要表现在两个方面:糖的分解代谢物阻遏作用和诱导作用。如葡萄糖对lac启动子控制的基因表达有抑制作用,其原因是??低胞内cAMP水平和排除诱导物。Pastan发现加入外源cAMP能克服葡萄糖的分解代谢物阻遏作用[2] 。De Bellis [3]研究了葡萄糖浓度对IPTG诱导作用的影响,当葡萄糖浓度为0.4%时,IPTG的诱导作用被抑制;当葡萄糖浓度为0.05%-0.1%时,IPTG诱导后有大量外源基因产物表达。因此,采用流加措施控制培养基中葡萄糖在低浓度,能减弱或消除葡萄糖的分解代谢物阻遏作用。乳糖能诱导lac启动子和tac启动子控制的基因表达。对这一类表达系统,用乳糖作为碳源较有利,乳糖同时可以作为诱导物。Kapralek等[4] 在研究tac启动子控制的凝乳酶原基因表达时,用乳糖替代IPTG作诱导物,提高了产物的最高含量。此外,我们在研究不同碳源对重组霍乱毒素B亚单位表达的影响时,发现乳酸作为碳源可提高产物的表达水平[5],其原因是乳酸代谢后可提高培养液的pH值。 在培养基中增加氨基酸、蛋白胨、蛋白质水解物、酵母抽提物能提高菌体密度和产物浓度。Mizutani等[6] 利用DO-stat流加亮氨酸菌体密度提高一倍,酶比活提高70%。另一方面,高浓度的某些氨基酸会抑制菌体生长及产物合成,如高浓度缬氨酸会抑制异亮氨酸的合成,从而抑制菌体生长[7] 。对分泌型产物,添加酪蛋白水解物有利于其合成及分泌。此外,Zhang等 [8]报道加甘氨酸能促进胞外酶的释放,认为甘氨酸可能会影响细胞代谢及碳源利用的途径。 无机磷在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子,如在DNA、RNA、蛋白质的合成,糖代谢途径的利用、细胞呼吸和ATP合成中均有磷参与。过量的无机磷会刺激葡萄糖的利用、菌体生长和氧消耗。磷对克隆基因表达的调节较为复杂。Jensen等 [9] 在进行补料培养时,降低培养基中磷的浓度,抑制菌体生长,再加大葡萄糖流加速率可进一步提高rMAE-hGH产量一倍。我们在复合培养基中加入0.05mol/L磷酸盐可使rCTB产量提高8倍左右[10] ,推测磷对不同表达系统的作用差异与受体菌基因型及启动子有关。 1.2 温度 温度对基因表达的调控机理很复杂,涉及DNA复制、转录、翻译及低分子量调节分子合成等方面。如杨胜利等[11] 的研究指出温度是在转录水平上调节E.coli A56(pPA52)内青霉素酰化酶基因的表达。温敏扩增型质粒在升温后,质粒拷贝数猛增,对菌体生长影响很大。对于此类重组菌,通常先在较低温度培养,然后再升温扩增质粒,提高剂量,再诱导外源基因表达,从而获得高产量。阻遏物CI 857 调节的P L /P R 启动子活性也受温度影响。CI