CFSE活染方法Protocol.pdf

2010/12/9 洪炜龙 细胞增殖检测：CFSE 原理和 CFSE 配制 一、原理 荧光染料 CFSE， 也可称为 CFDA SE （5，6- carboxyfluorescein diacetate， succinimidyl ester） 即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细 胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解 作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得 CFSE 成为一种良好的细胞标记物。当 CFSE 以含有两个乙酸基团和一个 succinimidyl ester 功能基团的形式存在时， 不具有荧光性质，而具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞；而当其扩散进入细 胞内环境，内源的酯酶可将其乙酸基团水解，此种形式的 CFSE 分子具有很高的 荧光活性，被激发能够产生绿色荧光，却不再具有膜通透性；同时，其含有的 succinimidyl ester 基团能与胞内的细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，最终形 成具有荧光的蛋白加合物。因此，当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白 被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一 半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。 这种现象可以在 488nm 的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细 胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。 二、CFSE 配制 用 DMSO 溶解成 5 mmol/L 的储存液，于- 20 ℃避光保存。使用时，用无血清 DMEM 培养液稀释成 5μ mol/L 的工作液备用。CFSE 试剂盒内有一小瓶 CFSE （A 试剂） 标明 500ug ，另有一小瓶DMSO （B 试剂），500ugCFSE 溶解于 180ulDMSO 即是 5mMstock solution。 三、CFSE 标记细胞 制作细胞悬液，加入等体积 CFSE 工作液，于 37℃孵育 10 min，用40%体积的冷 小牛血清立即终止标记 10min。 离心洗涤两次后，用适量的完全培养液重悬细 胞。 CFSE 的浓度国外报道从 0.5uM~20uM 都有，建议终浓度为 2.5-5uM。浓度太低， 细胞标记的荧光强度不够，太高了对细胞有毒性，且影响细胞增殖。标记孵育时 要经常摇匀。 2010/12/9 洪炜龙 CellTrace™ CFSE 细胞增殖试剂盒 贮存条件： • ≤ –20ºC 避免反复冻融，开盖前放置至室温。 • 干燥 • 避光 按要求保存，DMSO 和固体 CFSE 6 个月稳定，试剂溶液尽快使用。 分子量：557.47 Ex/Em: 492/517 nm 检测：荧光显微镜 FITC 滤片检测或流式 488nm 激发光检测。 CFSE (carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester 羧基荧光素双乙酸盐，琥珀酰亚胺酯) 被动扩散进入细胞，其本身是无色无荧光的，被细胞内的酯酶分解后产生高强度的荧光，该 荧光产物与胞内的氨基结合长时间留存于细胞内并可被乙醛固定。未结合的试剂与副产物扩 散至胞外基质中，被洗去。 传代或胚胎分裂分析，CFSE 与赖氨酸侧链或其他氨基基团反应，共价偶联至细胞内和细胞 表面的蛋白，细胞分裂时被平均分配至子代细胞，荧光强度降到母代细胞的一半。适合用于 胞内示踪，在细胞分裂或融合后分配至子代细胞中，并不会被转移至邻近的细胞。 在小鼠淋巴细胞迁移实验中，CFSE 注射进入小鼠体内后，标记的淋巴细胞的检测可长达 8 周。肝内注射荧光显微镜定位检测可长达 20 天。 试剂盒成分 • CellTrace™ CFSE (Component A), 10 瓶，每瓶 50 μ g • DMSO (Component B), 0.5 mL 使用浓度： 一般来说，长时间染色（超过三天）或快速分裂为 5～10uM，活力分析等短时间分析为 0.5～ 5uM 。 荧光显微镜为 25uM 。优化并使用尽可能低的浓度以保持细胞的正常生理状态。 不要使用含氨基的缓冲液或赖氨酸涂层的玻片，防止和 CFSE 发生反应。 2010/12/9 洪炜龙 试剂准备： 用前制备 CFSE 的 5mM 贮存液，一瓶 A 溶于 18ul DMSO