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碱性磷酸酶米氏常数测定
碱性磷酸酶米氏常数的测定 浙江中医药大学生命科学学院 生物化学教研室 [原理] 酶催化底物发生反应时,受多种因素影响,环境的温度、pH和酶的浓度等等,在环境的温度、pH和酶的浓度一定时,酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时。酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度,反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时,反应速度会达到一个极限值,即最大反应速度(Vmax),如图37所示 (一)?? Km值测定的意义 1.当反应速度为最大速度一半时,Vm = 1/2 Vmax,Km = [S] Km是指底物的浓度,含义:Km值等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度。 2. Km值可表示酶对底物的亲和力。 Km值愈小,酶与底物的亲和力愈大;表示不需要很高的 底物浓度便可容易地达到最大反应速度。 3.Km值是酶的特征性常数之一,只与酶的结构、酶所催化的底物和反应环境相关,与酶的浓度无关。 各种酶的Km值范围很广。大多数酶在0.01-100mmol/L间;对于同一底物,不同的酶有不同的Km值;多底物反应的酶对于不同底物也有不同的Km值。 (二)酶活性(U/L) 酶活性单位:在特定条件下,酶促反应在单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所需的酶量。 酶活性国际单位(IU):按照国际酶学会议的规定,1个酶活力单位是指在25℃、测量的最适条件(指最适pH、温度等)下,1分钟内能引起1微摩尔底物转化的酶量。 课后复习题 1.写出林贝方程 2.简要叙述碱性磷酸酶Km测定方法 * * [目的与要求] 通过碱性磷酸酶米氏常数的测定,了解其测定方法及意义。 学会运用标准曲线测定酶的活性,加深对酶促反应动力学的理解。 底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。 V = Vmax[S]/(Km+[S]) 上式中Vmax为最大反应速度,[S]为底物浓度,Km为米氏常数(Michaelis constant),而其中V则表示反应的起始速度。当V= Vmax/2时,Km =[S]。所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。因此Km的单位以摩尔浓度(mol/L)表示。 Km是酶的最重要的特征性常数,测定Km值是研究酶动力学的一种重要方法,大多数酶的Km值在0.01-100(mmol/L)间。 酶促反应的最大速度Vmax实际上不易准确测定,Km值也就不易准确测出。林-贝 (1ineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程,推导出如下方程式,即:(两边取倒数) 1/V = (Km +[S])/ Vmax[S] 或1/V = Km/ Vmax·(1/[S])+1/ Vmax (得类似:y=ax+b的直线方程 ) y = 1/V, a = Km/ Vmax, x = 1/[S] b = 1/ Vmax 此式为直线方程,以不同的底物浓度1/[S]为横坐标,以1/V为纵坐标,并将各点连成一直线,向纵轴方向延长,此线与横轴相交的负截距为-1/ Km,由此可以正确求得该酶的Km值,如图所示。 本实验以碱性磷酸酶为例,测定不同底物浓度的酶活性,再根据Lineweaver-Burk法作图,计算其Km值。 可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多,底物反应的酶对于不同的底物有不同的Km值。本实验以磷酸苯二钠为底物,由碱性磷酸酶催化水解,生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用,经铁氰化钾氧化,生成红色的醌衍生物,颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光度的大小可以计算出酶的活性,也可以从标准曲线上查知酚的含量,进而算出酶活性的大小。反应式如下: 三、[试剂与器材] 1.0.04mol/L 基质液 2.0.1mol/L碳酸盐缓冲液pH10(37℃) 3.碱性溶液 4.0.5%铁氰化钾 5.0.3% 4-氨基安替比林 6.酚标准液(0.1mg/mL) 7.37℃恒温水浴锅 8.可见光分光光度计 四、[操作步骤] 1.酚标准曲线的绘制 : 酚含量(μg): 0 5 10 20 30 40 (2
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