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第六章 凝胶层析 Gel filtration chromatography 对凝胶过滤介质的要求 ①亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用； ②稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长， ③具有一定的孔径分布范围； ④机械强度高，允许较高的操作压力（流速）。 凝胶特性参数 内水体积Vi：孔体积 外水体积Vo：颗粒间体积 柱床体积Vt Vt=Vo+Vi+ Vg Vt′= Vi+Vo 洗脱体积Ve Ve=Vo+KdVi Kd=(Ve-Vo)/Vi 凝胶特性参数 ①排阻极限（exclusion limit） 是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。例如Sephadex G50的排阻极限是30 kD。 ②分级范围（fractionation range） 能被凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。Sephadex G50的分级范围为1.5～30 kD。 ③凝胶粒径 凝胶一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，分离效率越高。凝胶粒径多用筛目或微米表示。软凝胶粒径较大，一般为50～150 μm（100～200目），例如，Sepharose和Sephadex凝胶粒径分布为45～165 μm 。 硬凝胶粒径较小，一般为5～50 μm 。 ⑤床体积（bed volume） 即1 g干燥凝胶溶胀后所占有的体积。Sephadex G50的床体积为9～11 cm3/g干胶。 ⑥空隙体积（void volume） 即V0值。空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定，一般使用平均相对分子质量为2000 kD的水溶性蓝色葡聚糖（blue dextran）。 对于商品化的凝胶过滤介质，厂商的产品目录中一般均给出其凝胶的各种性质，如分级范围、粒径、流速与压力的关系等，可参考使用。 GFC的优点 ①溶质与介质不发生任何形式的相互作用，因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率可接近100％； ②每批分离操作结束后不需要进行介质的再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度； ③作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高；与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性收率高； ④分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。 GFC的不足之处 ①仅根据溶质之间分子量的差别进行分离，分离较慢、需严格控制流速； ②经GFC洗脱展开后产品被稀释。因此需要在具有浓缩作用的单元操作（如超滤、离子交换和亲和色谱等）后使用。 凝胶的结构和性质 葡聚糖系 其中Sephadex G是最传统的软凝胶过滤介质之一，目前仍被广泛使用。Sephadex G是利用葡聚糖（右旋糖酐）交联制备的，交联剂一般采用环氧氯丙烷。Sephadex凝胶按交联度大小，分G 10～G 200共八种型号。 超胶（ultro-gel ACA) 琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶 比Sepharose 化学稳定性好，强度高，pH3-10，热稳定性不变 ACA 34：丙烯酰胺3%，琼脂糖4% 分离范围：生物胶P＜超胶＜琼脂糖 多孔玻璃微珠 Bio-Glas 500 孔径500? 将多孔硅酸盐玻璃加工制得，粉末状，可粘合 特点：化学稳定性高，强度大，耐高压， 对糖、蛋白有吸附，用聚乙烯二醇浸泡钝化 凝胶的预处理 将干胶颗粒悬浮于10倍以上吸液量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀。加热可使溶胀加速，即在沸水浴5小时即可达到凝胶的充分溶胀。 加热法既可节省时间又可排气、消毒。 商品悬浮液去除保存液、抽滤、洗涤、平衡 不需溶胀 装柱 1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。 2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，将凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，使凝胶继续沉集，装柱完毕，关闭出水口。 不能出现分层、倾斜、气泡 凝胶柱的平衡 通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。 部分收集器 核酸蛋白检测仪 记录仪 注意事项 1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损。 2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免压紧凝胶。 3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。 应用 去热原 Sephadex G-25 氨基酸 Kd=1 热原Kd=0 样品体积＜ 30