2材料和方.doc

2材料和方法 2.1 实验材料及处理 植物材料种植在山东农业大学温室内，温度为25±4℃，光照强度约为800μmolm-2s-1，相对湿度75%左右。以野生型番茄（Lycopersicon esculentum）品种“中蔬4号”，T2代（T1代纯合子）转正、反义LeGPAT基因番茄植株T2-5(+)、T2-19(+)、和T2-2(-)、T2-16(-) 为试材。种子浸种催芽5d生根后分别播于直径15cm、高10 cm的塑料盆中，蛭石作基质，Hoagland营养液培养，放置于温室中生长。番茄生长至8片真叶时用于低温逆境处理，于处理后选取最上部完全展开叶进行光合、荧光参数测定和D1蛋白修复的测定。或于处理后取叶片，液氮冷冻，保存于-70℃用于活性氧产生、抗氧化酶活性等测定。 49 2.2转基因番茄植株的PCR检测 2.2.1CTAB法微量法提取基因组DNA 1、取0.1-0.2 g新鲜叶片，置液氮中研磨成粉，转移到1 .5 ml离心管中，加入1 ml 2×CTAB提取缓冲液，轻轻搅动，使粉末充分散开，于65℃水浴中保温20 min。 2、随后，4℃，10000 rpm离心10 min。 3、上清液转入一新离心管中，加入500μl氯仿/异戊醇（24:1），轻轻混匀，放置5 min。 4、4℃，8 000 rpm离心10 min。 5、将上清液转入另一离心管中，加入500μl冷的异丙醇，混匀，4℃放置10 min。 6、4℃，8 000 rpm离心10 min，去掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上。 7、75%乙醇洗沉淀，置超净工作台中20 min吹干。 8、加入50μl TE溶解DNA，-20℃保存备用。 2×CTAB提取缓冲液(100 ml)：取1M Tris.Cl 10 ml；0.5 M EDTA 4ml；NaCl 8.182 g；CTAB2.0 g；PVP 3.0 g。将上述成分用蒸馏水溶解后，定溶到1 00 ml。灭菌后加入加β-巯基乙醇200μl，备用。 2.2.2转基因植株的PCR筛选 用CTAB微量法提取转基因番茄叶片中的总DNA，以此为模板，用合成的引物进行PCR。 正向筛选引物均以PBI和GP6为引物；反向筛选引物均以PBI和GP5为引物。 1、反应体系如下： PCR buffer 5μl MgCl2 4μl dNTP 1μl PBI 1μl GP5/GP6 1μl DNA 1μl TaqE 0.5μl ddH2O 36.5μl Total 50μl 2、反应程序如下： 94℃预变性8 min 94℃变性50 s 35个循环 48℃退火30 s 72℃延伸90 s 72℃后延伸5 min 取PCR产物10μl，进行琼脂糖凝胶电泳检测。 2.3转基因番茄叶片膜脂含量的测定方法 2.3.1、脂类的提取：参照Siegenthaler等（1989）的方法。 1)将研钵置于冰上预冷10 min，在番茄叶片上打取5个叶园片放入研钵中，加入9 ml氯仿:甲醇（1:2），将叶片研磨成匀桨； 2)将匀桨转移到50 ml大离心管中，于振荡器上混匀后静置20 min； 3)向离心管中加入3 ml氯仿和5.4 ml 0.9M KCL，混匀后1500 g离心15 min；离心的同时将硅胶板在点样处做好标记并置于105℃烘箱中活化1 h； 4)离心后吸取下层液入尖底玻璃管中并用N2吹干； 5)将管底粉末用0.2 ml氯仿:甲醇（2:1）溶解、定容。 2.3.2、测定叶绿素含量：参照Bruinsma（1961）的方法。 用进样针取10μl样品，加入4.99 ml 80%丙酮混匀后，1000 g离心2 min，取上清液。然后以80%丙酮为参比，使用UV-160型份光光度计测定样品在645 nm和663 nm下的吸光值，并通过下面的公式计算叶绿素浓度：叶绿素浓度（mg/ml）＝((20.29*D645+8.05*D663)/1000)*500 2.3.3、脂类成分分析，即双向薄层层析（TLC）：参照Xu和Siegenthaler（1997）的方法。 1)按照叶绿素含量为50μg的量来上样，将样品点在硅胶板上左下角距左侧和下侧边缘均为1 cm处，样品要尽量点的均匀； 2)点完样后用吹风机将硅胶板上的样品吹干，放入第一向展层液中（丙酮:苯:水＝91:30:8）展层；当展层液接近硅胶板的上边缘时，将硅胶板取出，用吹风机吹干，将硅胶板逆时针翻转90°置于第二向展层液（氯仿:甲醇:28%氨水＝13:7:1）中层析； (3)展层结束后，将硅胶板取出，用吹风机吹干，向硅胶板上均匀喷洒显色剂樱草灵，吹干后在紫外灯下观察，标出各类脂的位置。 2.3.4、脂类的甲脂化： 参照苏维埃（1980）的方法并加以改