Biolog微生物鉴.doc

Biolog微生物鉴定步骤 一 检测原理 Biolog微生物鉴定系统测试的是微生物在鉴定板中利用或氧化化和物的能力。测试会产生特征性的紫色孔模式，组成代谢指纹。所有必需的营养物质和生化试剂都预先加进96孔板中，四唑紫是一种氧化还原染料，指示碳源的利用情况。.鉴定步骤非常简单，纯化分离到的菌株经扩大培养，再制成接种液加到鉴定板中。在培养过程中，一些孔中的化学物质能被氧化并将显色物质成紫色，对照孔（A-1）和阴性孔仍然为无色。鉴定板在相应的培养条件下培养4-6小时或16-24小时即可形成代谢模式。系统软件自动和数据库对比，如果能找到合适的匹配，就可以得出一个鉴定结果。 二 所需器材和消耗品： ?培养基、接种液、巯基乙酸钠、长棉签、接种棒、储液槽、八道移液器、移液器头、浊度仪、浊度标准品、控温培养箱和相应的鉴定板。其中接种液自行配制，接种棒、储液槽可选用国产品牌代替。 三 鉴定步骤： Biolog微生物鉴定样品处理步骤 分离纯化培养基 BUG+B 通用培养基加羊血 BUA+B 厌氧培养基加羊血 BUY 酵母培养基 2%ME 2%的麦芽汁提取物 革兰氏染色和菌落菌株形态观察 革兰氏染色结果 革兰氏阴性 革兰氏阳性 厌氧菌 酵母菌 丝状真菌 确认实验 氧化酶反应阳性 氧化酶反应阴性、三糖铁实验A/A或K/A 需在巧克力培养基上或需要6.5% CO2培养 确认实验 氧化酶反应阴性、三糖铁实验K/K或K/Aw 微生物类型 GN-NENT 非肠道菌 GN-ENT 肠道菌 GN-FAS 苛生菌 GP-COCCUS-ROD杆球菌、GP-COCCUS球菌、GP-ROD杆菌 GP-ROD （芽孢杆菌） AN 厌氧菌 YT 酵母菌 FF 丝状真菌 扩大培养基 BUG+B BUG+B 巧克力培养基 BUG+B BUG+M+T BUA+B BUY 2%ME 培养温度 30℃ 35-37℃ 35-37℃ 35-37℃ 30℃ 35-37℃ 26℃ 26℃ 培养气体 空气 空气 6.5% CO2 空气或6.5% CO2 空气 无氢气的厌氧环境 空气 空气 接种液类型 GN/GP-IF GN/GP-IF+T GN/GP-IF+T GN/GP-IF+T GN/GP-IF AN-IF 水 FF-IF 接种浊度/ 浊度标准管 52%T GN-NENT 61%T GN-ENT 20%T GP-COCGP-RODGN-FAS 20%T GP-COCGP-RODGN-FAS 28%T GP-ROD SB 65%T AN 47%T YT 75%T FF 鉴定板类型/ 每孔菌悬液的量 GN2 150μl GN2 150μl GN2 150μl GP2 150μl GP2 150μl AN 100μl YT 100μl FF 100μl 培养时间（小时） 4-6,16-24 4-6,16-24 4-6,16-24 4-6,16-24 4-6,16-24 20-24 24,48,72 24,48,72,96 第一步： 在用户自己的培养基上纯化菌株，如果菌株为冻干或冷冻样品，需要传代培养2-3代，让菌株恢复活力。 对纯化好的菌株做革兰氏染色，确定菌株是革兰氏阴性还是阳性。观察菌落外部形态或用显微镜观察菌株形态，确定是酵母还是丝状真菌，是球菌还是杆菌。 如果是革兰氏阴性菌，还需要最终确认是肠道菌、非肠道菌或苛生菌。方法是，氧化酶阳性或氧化酶阴性但三糖铁实验为K/K或K/Aw，则该菌株为非肠道菌(GN-NENT)，氧化酶阴性以及三糖铁实验为A/A或K/A，则该菌株为肠道菌(GN-ENT)。如果菌株①需要在巧克力培养基上或需要6.5% CO2培养，②在BUG+B培养基上生长非常差，形成针尖大小的菌落，那么可以认为这些菌是苛生菌(GN-FAS)。大多数苛生菌都是从哺乳动物的呼吸道里分离出来的，如Actinobacillus, Alysiella, Brucella, Capnocytophaga, CDC Group DF-3, CDC Group EF-4, Eikenella, Haemophilus, Kingella, Moraxella, Neisseria, Simonsiella, Suttonella,和Taylorella。 如果是革兰氏阳性菌，用革兰氏染色可以很容易的区分球菌和杆菌，推荐再做一个过氧化氢酶实验，最终确定是球菌还是杆菌。通过革兰氏染色或观察菌落形态可以区分出芽孢杆菌。 微生物的扩大培养应该用Biolog推荐的培养基和培养条件，以便使微生物达到最佳的代谢活性，进而准确的和数据库中的代谢模式匹配。 微生物应该是新鲜的，确保其处于指数增长期，因为一些菌株在达到稳定期时会失去生存能力或代谢活