沉淀反应200803课件.pptVIP

沉 淀 反 应 马荣红 协和医院检验科 沉淀反应（precipetation）是可溶性抗原与相应抗体特异性结合所出现的反应。 1905 凝胶内沉淀试验 1946 试管免疫扩散技术 1965 单向免疫扩散技术 1967 散射比浊法 液体内沉淀试验 一、絮状沉淀试验 将抗原与抗体溶液混合在一起，在电解质存在下，抗原与抗体结合，形成絮状沉淀物。 这种沉淀试验受到抗原和抗体比例的直接影响，因而产生了三种最适比例的基本测定方法。即 抗原稀释法 抗体稀释法 方阵滴定法 表6-1 最适比方阵测定法 二、免疫浊度测定（immunoturbidimetry) 是将现代光学测量仪器与自动分析检测系统相结合应用于沉淀反应。 免疫浊度测定的影响因素 1.抗原抗体的比例 免疫浊度测定的影响因素 2、抗体的质量 特异性强、效价高、亲和力高、R型抗体 3、抗原抗体复合物形成的反应溶液 最适pH为6.5-8.5，常使用磷酸盐缓冲液 4、增浊剂的作用 消除抗原、抗体分子周围的电子云和水化 层，促进分子靠近、结合。 凝胶内沉淀试验 最常用的凝胶为琼脂糖 原理：可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原与抗体浓度比例恰当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 大分子（分子量为20万以上）物质在凝胶中扩散较慢，可利用这点识别分子量的差别。 根据抗原与抗体反应的方式和特性 ， 分为 单向扩散试验 原理：在琼脂胶中混入一定量抗体，使待测的抗原溶液从局部向琼脂内自由扩散，在一定区域内形成可见的沉淀环。根据试验形式可分为试管法和平板法两种。 （一）试管法 沉淀环的数目和形态受抗原和抗体性质的影响。 多种抗原 多条区带 上部沉淀带 抗原量少或抗体量多 　（二）平板法 此法由Mancini于1965年提出，是目前最常用的简易抗原定量技术，其要点是：将抗体或抗血清混入约0.9％琼脂糖内（约50℃），未凝固前倾注成平板，凝固后在琼脂板上打孔（一般直径约3～5mm），孔中加入抗原溶液，放室温或37℃让其向四周扩散，24～48h后可见周围出现沉淀环 。 上排为5个不同的参考 中、下排为患者血清 下排右2为一异常病理血清 测量沉淀环的直径或计算环的面积。沉淀环直径或面积的大小与抗原量相关，但不是直线相关，而是对数关系。同时，这种沉淀环与分子量和扩散时间有关。抗原含量与环径的关系有两种计算方法： 1. Mancini曲线适用于大分子抗原和长 时间扩散（＞48h）的结果处理。扩散环直径的平方与抗原浓度呈线性关系 ； C/d2=K C 抗原浓度 d 沉淀环直径 2. Fahey曲线这种曲线适用于小分子抗原和较短时间（24h）扩散的结果处理。浓度的对数与扩散圈直径之间呈线性关系； logC/d=K 待检蛋白质的3条要求： ①备有仅对某待测抗原的单价特异抗血清； ②备有已知含量的标准品； ③待测品含量在1.25mg/L以上（单向扩散技术的敏感度）。 曾经最常用于临床检测的项目有IgG、IgA、IgM、C3、C4、转铁蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多种血浆蛋白。 影响因素 1．抗血清不但要求亲和力强、特异性好、效价高，而且还应注意存放的方法，防止效价下降。 2．标准曲线测定必须同时制作，决不可一次做成，长期应用。 3．测定时必须同时加测质控血清，以保证测量准确性。 影响因素 4．有时出现扩散圈呈两重沉淀环的双环现象。这是由于出现了不同扩散率、但抗原性相同的两个组分。例如α重链病血清中出现的α重链和正常IgA发生反应，就形成内外两重环 。 影响因素 5. 在单向扩散试验时，有时会出现结果与真实含量不符，这主要出现在Ig测定中。 6．测得结果的假阳性升高现象。 双向扩散试验 原理：在琼脂内抗原和抗体各自向对方扩散，在最恰当的比例处形成抗原抗体沉淀线，观察这种沉淀线的位置、形状以及对比关系，可作出对抗原或抗体的定性分析。 双向扩散试验 方法：1.试管法 　　试管法由Oakley首先报道。先在试管中加入含抗体的琼脂，凝固后在中间加一层普通琼脂，冷却后将抗原液体加到上层。放置后，下层的抗体和上层的抗原向中间琼脂层内自由扩散，在抗原与抗体浓度比例恰当处形成沉淀线。此法分析效果与Oudin法相似，在临床