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蛋白质的结构与功能Structure and Function of Protein （三）蛋白质的变性、沉淀和凝固 吴宪教授1931年：“天然Pr分子借助次级键连接而成一种紧密，有规则的空间结构，变性作用使次级键破坏从而使结构松散”。 RNase的变性与复性 变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。 大部分蛋白质均含有带共轭双键的Tyr和Trp。这两种AA在280nm 附近有特征性吸收峰。在此波长范围，Pr的OD280与其浓度成正比。利用这个性质，可以对蛋白质进行定量测定。 反应 试剂 颜色 反应基团 有此反应的Pr及AA 双缩脲反应 NaOH,稀CuSO4 紫或粉 2个以上肽键 所有蛋白质 Millon反应 Millon,硝酸，亚硝酸 红色 酚基 Tyr 黄色反应 HNO3及NH3 黄、橘黄 苯基 Phe,Tyr 乙醛酸反应 乙醛酸H2SO4 紫红 吲哚 Trp 坂口反应 次氯酸钠,萘酚 红色 胍基 Arg Folin酚试剂反应 CuSO4磷钨酸-钼酸 兰色 酚基 Tyr 茚三酮反应 茚三酮 紫兰色 游离氨、羧基 Pro和羟Pro呈黄色 二、蛋白质分离和纯化 研究Pr的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。 1. Pr来源：微生物、动物或植物细胞； 2.随时测定Pr活性并检测Pr含量; 3.分离和纯化过程须在温和的条件下进行。 （一）盐析法（Salting out) 定义：加入大量中性盐以破坏Pr的稳定因素并 使从溶液中沉淀析出的现象。 原理:破坏Pr两个稳定因素：水化膜和电荷层 中性盐：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。 半饱和硫酸铵沉淀球Pr 饱和硫酸铵沉淀清Pr 优点：Pr不变性，常用。 （二）电泳（electrophoresis) 定义：带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。 Pr分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷，故可在电场中发生移动。不同的Pr分子所带电荷量不同，且分子大小也不同，故在电场中的泳动速度也不同，由此可彼此分离。 （见实验理论 ） 电泳 带电粒子在电场力作用下向着所带电荷相反的方向泳动的现象叫电泳。利用这一原理，可以将蛋白质进行分离纯化。 板状电泳 试剂：丙酮、乙醇、甲醇等亲水溶剂 能与水以任意比例混合，有脱水作用。 原理：① 脱水作用；② ↓水的介电常数和蛋 白质溶解度。 优点：分辨率优于盐析法，能使某一Pr在狭小 有机溶剂浓度范围内沉淀。 缺点：易使Pr变性 应用：pI沉淀Pr。调节溶液pH到某Pr的pI，加上丙酮破 坏水化膜，Pr沉淀。 注意：防止Pr在分离过程中发生变性：①0－4 ℃下进行； ②有机溶剂浓度不能太高，Pr沉淀后立即分离 （三）层析（chromatography) 定义：利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离分析的技术方法。 方法：离子交换层析；凝胶层析；吸附层析及亲和层析等。 离子交换层析法 定义: 利用离子交换树脂作为支持物，将带有不同 电荷的Pr进行分离的方法。 分类:阳离子交换树脂,如羧甲基纤维素等， 阴离子交换树脂,如二乙基氨基乙基纤维素等 原理:带正电荷多的Pr与树脂结合较强，而带正电荷 少的Pr与树脂结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的Pr进行分离。 凝胶过滤法 亲和层析法 （五）超速离心 利用物质密度的不同，Pr经超速离心后，分布于不同的液层而分离。