南京农业university生物化学教学课件6.ppt

种类 ＊ 液相分子杂交 Absorb D.S. DNA ＊固相分子杂交 （1975 E. M. Southern） 1975 E. M. Southern 1977.??? J.C. Alwine 1978.??? Hany Towbin ＊ 原位分子杂交 (In situ hybridization ) Southern blot Northern blot Western blot S.S. DNA × S.S. DNA S.S. RNA × S.S. DNA Protein × antibody Southern Blotting Northern Blotting Western Blotting 五 DNA 一 级 结 构 分 析 （DNA sequencing ） 第3节 核酸的理化性质 一 物理性质 DNA为白色纤维状固体; RNA为白色粉末状固体? 1、形态 2、溶解性 微溶于水，不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂；DNA在溶液中粘度大，RNA粘度小。 核酸既含有酸性的磷酸基团，又含有弱碱性的碱基，故可发生两性解离。其解离状态随溶液的pH值而改变。 核酸的理化性质 3、两性解离 由于磷酸基团的酸性很强，所以pI较低，整个分子相当于多元酸。 利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的等电点来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。 嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外光。在260nm处有最大吸收峰。对于纯的DNA或RNA，可以通过测得A260来测定核酸的含量。 纯的DNA：A260/ A280 =1.8 纯的RNA：A260/ A280 =2.0 二 紫外吸收性质 A260/ A280值可以反映核酸的纯度。 核酸的理化性质 核酸变性后，在260nm处的吸收值上升，这叫增色效应(hyperchromic effect)。增色效应常可用来衡量DNA变性的程度。 三 核酸的变性 核酸在某些物理或化学因素的作用下，其空间结构发生改变，从而引起理化性质的改变及生物活性的降低或丧失叫变性。引起变性的因素有：加热、酸碱、尿素、甲醛等。 1.增色效应 核酸的理化性质 DNA分子变性( DNA denaturation ) ● D.S. DNA S.S. DNA ( 加温, 极端pH, 尿素, 酰胺 ) 变性过程的表现 ☆ S.S. DNA粘度降低 ☆ S.S. DNA 沉降速度加快 ☆ S.S. DNA分子的A 260 nm UV 值上升 ( Hyperchromicity ) 热变性中光吸收达到最大吸收（完全变性）一半（双螺旋结构失去一半）时的温度称为DNA的熔点或熔解温度（Tm）。 2. 熔解温度 核酸的理化性质 三 核酸的变性 热变性曲线 (熔解曲线) 图5-26 Tm的示意图 在DNA发生热变性的过程中，A260随温度的变化曲线。 核酸的理化性质 1.185 1.0 1.37 OD ℃ Concentration 50 ?g/mL D.S DNA A260 = 1 S.S DNA A260 = 1.37 dNTPs A260 = 1.60 Tm = OD增加值的中点温度(一般为85-95℃) Tm值与DNA的均一性、G-C含量、介质离子强度、pH等因素有关。 核酸的理化性质 三 核酸的变性 Marmur-Doty Formula Evaluation GC% of DNA 1x SSC GC% = 30?70% ( 0.15 M Nacl + 0.015 M Sodium Limonate ) Tm1 ＜ Tm2 ℃ 1.0 1.185 1.37 OD what is meaning ? Tm = 69.3 + 0.41 × GC% l??? 增色效应的跳跃现象 ( Jump of Hyperchromicity ) 高分子量的DNA分子在热变性过程中, 富含AT区域首先发生 变性, 然后逐步扩展, 表现增色效应的跳跃现象, 使变形过程加快. rich AT rich AT ● 影响 Tm值的因素 ☆ 在 A,