中药益气化纤汤抗大鼠肺纤维化的实验研究.docVIP

　　中药益气化纤汤抗大鼠肺纤维化的实验研究 作者：蔡望喜， 尹杉杉， 常建方 【摘要】 　　[目的] 观察益气化纤汤对肺纤维化模型大鼠肺泡巨噬细胞(AM)和肺间质巨噬细胞(IM)中转化生长因子β1(TGFβ1)mRNA表达的影响。[方法]选用、IM，采用分子原位杂交法(ISH)检测TGFβ1mRNA的表达。[结果]模型组AM、IM中TGFβ1mRNA表达阳性细胞百分率及积分光密度(D)值显著升高(均Plt;0.01);益气化纤汤可显著降低AM、IM中TGFβ1mRNA表达阳性细胞百分率及D值(均Plt;0.01),其作用与氢化可的松相仿。[结论]益气化纤汤 治疗 肺纤维化的作用可能与其能降低TGFβ1的表达，抑制纤维化的 发展 进程有关。 【关键词】 益气化纤汤/药 理学 肺纤维化/中药疗法 转化生长因子β 肺泡巨噬细胞/病理学 肺间质巨噬细胞/病理学 疾病模型 动物 大鼠 　　肺纤维化进程中转化生长因子β1(TGFβ1)的作用极为关键 。TGFβ1是致纤维化关键性的细胞因子，它可以通过自分泌、旁分泌等不同的方式，调节细胞增殖、分化、移行，促进成纤维细胞对胶原蛋白、纤维连结蛋白、蛋白多糖等细胞外基质的合成和沉积，从而导致脏器纤维化的形成[1]。益气化纤汤为我院治疗特发性肺纤维化的验方。本实验依据病理进程，分别收集实验第 7 天肺泡巨噬细胞(AM)、第 28 天肺间质巨噬细胞(IM)标本，采用分子原位杂交法(ISH)观察不同时间点巨噬细胞中TGFβ1 mRNA的表达情况，探讨益气化纤汤治疗肺纤维化的作用机制，现报道如下。 　　 1 材料与方法 　　1.1 实验动物 雄性SPF级I1640消化液，其中Ⅰ 型胶原酶浓度为200U/mL，DNA酶浓度为0.02mg/L ，抽滤灭菌，4℃ 保存。第28天处死大鼠，常规消毒，在超净工作台内，取右肺于无菌培养皿中。用DHanks 液洗净，剪碎肺组织，玻璃匀浆器研磨，离心(4℃、2500r/min×15min)，弃上清，加入消化液消化(37℃、体积分数5%CO2)2～3h后取出，离心(4℃、2500r/min×10min )，DHanks 液反复吹打后过100 目筛网(使之成为单细胞)，离心(4℃、2500r/min×15min )，弃上清。在试管中加入适量Ficoll分离液，将沉淀与DHanks 液充分混匀，将混悬液缓慢滴加于分离液面上，水平离心(4℃、2500r/min×20min )。离心后管内分为3层，上层为血浆和DHanks液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，主要为淋巴细胞和单核细胞(包括巨噬细胞)，用毛细管吸取单个核细胞，置入另一试管中，加入5倍以上体积的DHanks液，离心(4℃、2500r/min×10min )， 洗涤细胞2次，将灭菌盖玻片置于6 孔板内，滴加分离的细胞，加入适量RPMI1640培养液，37℃、体积分数5%CO2培养2～3h，在倒置显微镜下观察细胞贴壁后取出，生理盐水冲洗2 次，在玻片上用DEPC 处理的多聚甲醛固定30min，蒸馏水冲洗4 次，吹干，-20℃保存。分子原位杂交(ISH)按试剂盒说明书进行。 　　1.5 观察指标 　　1.5.1 阳性细胞百分率 光镜下观察，胞质中出现棕黄色颗粒为阳性，每一玻片随机取5个视野， 计算 阳性巨噬细胞数，再根据5个视野中总巨噬细胞数算出该片平均阳性细胞比例。 　　1.5.2 积分光密度(D) 样本玻片置于高清晰度彩色病理图文报告分析系统(HMIAS2000)配套的Olympus显微镜下，CCD系统摄取细胞图像(40×10)，作尺寸及光密度定标。每例标本随机选取100个分散、无重叠的目标细胞，采用不同彩色分刻法获得图形，由系统计算出该切片TGFβ1 mRNA阳性面积的D值。 　　1.6 统计学方法 计量资料用F检验，计数资料采用Wilcoxon 秩和检验，组间比较采用多因素方差分析。 　　 2 结果 　　大鼠模型组AM、IM中TGFβ1 mRNA表达阳性细胞百分率及D值与假手术组比较显著升高(均Plt;0.01)，提示博莱霉素能造成大鼠TGFβ1 mRNA表达增高;氢化可的松组AM、IM中TGFβ1 mRNA表达阳性细胞百分率及D值与模型组比较差异均有显著性意义(Plt;0.05或Plt;0.01);益气化纤汤组与模型组比较，AM、IM中TGFβ1 mRNA表达阳性细胞百分率及D值显著下降(均Plt;0.01)，提示益气化纤汤组与氢化可的松组有同样的生物学特性，能干预博莱霉素造成的TGFβ1 mRNA表达增高。结果见表1、表2，图1、图2(彩图见第316页)。表1 各组