植物RNA的分离纯化〔LiCl沉淀法〕.pptVIP

实验三 植物RNA的分离纯化(LiCl沉淀法) 一、实验原理 总RNA包括线粒体RNA、叶绿体RNA、tRNA和mRNA。与DNA一 样，RNA在细胞中也是以与蛋白质结合的状态存在。RNA分子主 要存在于细胞质中，约占75%，另有10%存在于细胞核内，15% 在细胞器中。RNA以rRNA的数量最多(80-85%)，tRNA 及核内小 分子RNA占10%-15%，而mRNA 分子只占1%-5%。mRNA 分子大小 不一，序列各异。 RNA提取一般使用蛋白质强变性剂有效抑制RNA酶活性，同 时并使DNA变性，再通过有机溶剂反复抽提去掉蛋白质、多糖 等物质，在RNA沉淀剂的作用下，针对性分离出RNA。 总RNA提取原则：① 保持核酸结构的完整性；② 排除其 它分子的污染。 二、仪器设备 高速冷冻离心机、电子天平、冰箱 三、材料及试剂 1.材料：植物任何部分的新鲜组织 2.试剂： ① 水饱和酚(pH4.9)； ② 苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混合溶液； ③ 3mol/L NaAc(pH 5.2)； ④ RNA提取缓冲液：内含0.2mol/L Tris-HCl(pH 8.0)、0.4mol/L LiCl、25mmol/L EDTA和1%SDS； ⑤ 2mol/L LiCl； ⑥ 75％乙醇； ⑦ 无水乙醇； ⑧ 灭菌双蒸水(ddH2O，无Rnase)； ⑨ 氯仿。 四、操作步骤 1．取取植物材料0.5g，放入预冷的研钵中，加入0.1ml?-巯基 乙醇 。 2．液氮中充分研磨，中间可补充液氮，直到将材料磨成粉末。 3．将粉末迅速分装到3-5个1.5ml离心管中，分别加入0.6ml提 取液，剧烈振荡2-3min。 4．分别加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇混合液，振荡1min，冰 上放置5min。 5．4℃、12000g离心10min。 6．将上层水相转到对应的灭菌离心管中，加入等体积的苯酚: 氯仿:异戊醇 混合液，振荡混匀，室温下、12000g 离心 5min。 7．重复步骤6，直至无白色界面物质。 8．将水相转至对应的灭菌离心管中，加入等体积氯仿振荡混 匀，以除去痕 量的苯酚。 9．室温下、12000g离心5min。 10．将上层水相转移至对应的灭菌离心管中，加入1/10体积的 NaAc(3mol/L, pH 5.2) 和2倍体积的无水乙醇，混匀，-70℃ 放置30min。 11．4℃、12000g离心20min。 12．弃去上清夜，向沉淀加入0.3ml LiCl(2mol/L)，并振荡溶 解，冰上静置 10－30min。4℃、12000g离心20min。 13．弃去上清液，加入0.3ml灭菌双蒸水(ddH2O，无RNase)， 振荡使沉淀溶解。 14．加入1/10体积的NaAc(3mol/L, pH 5.2) 和2倍体积的无水乙 醇，混匀，-70℃放置30min。 15．4℃、12000g离心20min。 16．弃去上清液，沉淀分别用70%乙醇和无水乙醇1ml洗涤，并 短暂离心。 17．小心吸去残留的乙醇，空气中凉干3min。 18．RNA用20-30?l无菌水溶解，贮藏于-70℃备用。 19．RNA的浓度测定和纯度分析 取2-5?lRNA溶液稀释至100?l，于紫外核酸蛋白检测仪上测 定A260、A280和A320的OD值，并计算RNA浓度和得率。 注：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm，对纯的RNA来 说，OD260／OD280为2.0，1个OD260约为40?g/ml RNA。 20．RNA的完整性检测 1.2%琼脂糖凝胶电泳 在紫外检测仪下观察，完整的总RNA样品应呈现三条带： 28S、18S、和5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应该为18S 【注意事项】 1．条件允许的实验室应专门辟出RNA操作区，离心机、移液 器、试剂等均应专用，RNA操作区应保持清洁，并定期行除 菌。 2．操作过程中应始终戴一次性手套，并经常更换，以防止手、 臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带到试管或污染 用具。 3．避免在操作过程中说话聊天。 4．配制溶液用的酒精、异丙醇、Tris等应采用未开封的新瓶。 5．所有旧塑料制品都必须用0.5mol/L的NaOH处理10min，用 双蒸水彻底冲洗，DEPC-H20浸泡过夜后灭菌。 6．所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下烘烤6h或更 长时间。 7．配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC在37℃处理12h以上， 然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当 用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除 菌