人转录因子USF基因在大肠杆菌中的表达、纯化及在FAK启动子中的结合研究.docVIP

　　人转录因子USF基因在大肠杆菌中的表达、纯化及在FAK启动子中的结合研究 【摘要】 目的：在大肠杆菌中表达人源转录因子USF（upstream stimulatory factor）并进行分离纯化，进一步 分析 其在FAK(focal adhesion kinase)启动子中的DNA结合能力。 方法 ：将人源USF cDNA克隆到表达质粒pET28a载体，然后将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达带His6Tag的融合蛋白HisUSF，通过镍柱亲和层析纯化，SDSPAGE分析鉴定。EMSA分析纯化后的蛋白与FAK启动子的DNA 结合情况。结果： HisUSF在大肠杆菌中获得高效表达，镍柱亲和层析纯化得到了高纯度的蛋白，并能够结合到FAK的启动子上。结论：获得高效表达的高纯度HisUSF融合蛋白，为USF对其靶基因的结合与转录调控的进一步 研究 奠定了基础。 【关键词】 USF基因 粘着斑激酶 蛋白表达 转录因子 许多重要的细胞活动是由bHLH类型（basic helixloophelix）的转录因子所调控的,USF(upstream stimulatory factor)就是这种类型的重要的转录因子。它含有helixloophelix结构域,以二聚化的形式结合到靶基因的调控区，调节基因的转录[1]。它在靶基因上结合位点含有CACGTG Ebox结构。 USF最初是作为腺病毒晚期启动子的反式激活因子而被发现的[1]，后来的研究证明USF在组织中的分布很广泛[23]，许多的细胞基因也受到其调控[48]。受其调控的靶基因多是和细胞外基质、细胞生长、细胞增殖等相关的基因[47]及对压力刺激反应的基因[8]。USF在一些肿瘤中的表达水平明显异常[9]。 为了研究USF在FAK(focal adhesion kinase)基因调控中的作用，我们首先用原核表达系统获得USF蛋白，并初步分析其在FAK基因启动子中的结合能力。 1 材料与方法 1.1 材料 pET28a、大肠杆菌Top10、BL21（DE3）由本实验室保存。含有人USF cDNA的质粒pRK5huUSF由 Philippe Pognonec 赠送（Institute of Signaling,Developmental Biology and Cancer Research, Parc Valrose, 06108 Nice cedex 2, France）。PCR试剂、限制性内切酶、T4连接酶、T4多聚核苷酸激酶等购自TaKaRa公司，IPTG购自华美生物公司，3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒购自申能博彩生物 科技 有限公司，NiIDA填料购自Phamarcia公司，ProbeQuantTMG50微型离心柱购自安玛西亚，32PdATP购自北京福瑞公司。 1.2 方法 1.2.1 重组质粒的克隆 首先，按照USF编码序列设计引物，USF cDNA 扩增引物如下：USF上游引物（含EcoRI位点）5′CCG GAATTC ATG AAGGGGCAGCAGAAAACAGC3′，USF下游引物（含HindⅢ）5′GTCCC AAGCTT TTAGTTGCTGTCATTCTTGATGAC3′，扩增的cDNA 大小为933 bp ，USF cDNA编码310个氨基酸。PCR产物纯化回收后，经EcoRI和HindⅢ双酶切，用T4连接酶连接到同样酶切回收的pET28a载体中，转化大肠杆菌Top10，卡那霉素抗性板筛选阳性克隆，经酶切鉴定后送上海英俊（Invitrogen）公司测序。 1.2.2 融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达和纯化 将重组质粒pET28aUSF转化BL21（DE3）大肠杆菌，挑单克隆于1 L有卡那霉素的新鲜LB液体培养基中37 ℃摇菌培养，当其A260约达到0.8时，加入终浓度为1 mmol·L-1 IPTG，诱导3 5 h，收获菌体，进行SDSPAGE分析。将表达菌体重悬于 60 ml Buffer B（50 mmol·L-1 Na3PO4，300 mmol·L-1 NaCl，10 mmol·L-1 imidazole，pH 8.0），超声破碎，离心取上清，NiIDA亲和层析柱由Buffer B 平衡过后上样,再用Buffer C（50 mmol·L-1 Na3PO4 ，300 mmol·L-1 NaCl，50 mmol·L-1 imidazole，pH 8.0）洗去杂蛋白，最后通过Buffer D（50 mmol·L-1 Na3PO4，300 mmol·L-1 NaCl，250 mmol·L-1 imidazole，pH 8.0）洗脱，收集目的蛋