人骨肉瘤MG63多药耐药细胞亚系建立及生物学特性分析.docVIP

　　人骨肉瘤MG63多药耐药细胞亚系建立及生物学特性分析 作者：刘岩 张德宝 杨华　孙大辉 【摘要】 目的 建立阿霉素(DXR)诱导的人成骨肉瘤MG63多药耐药细胞株亚系MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100并观察其生物学特性。方法 以DXR为诱导剂，采用逐步增加剂量的方法诱导MG63细胞，建立多药耐药细胞株亚系MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100;MTT法检测药物敏感性;光镜、透射电镜观察细胞形态及超微结构变化，绘制细胞生长曲线;流式细胞术检测细胞周期、凋亡指数。结果 (1)经DXR 6个月的诱导建立了MG63/DXR细胞株亚系。(2)MG63/DXR对DXR的耐药指数为 76.87，对长春新碱、氨甲蝶呤、环磷酰胺亦产生不同程度的交叉耐药。(3)光镜观察可见：MG63细胞排列规则，形态呈梭形，大小一致;MG63/DXR细胞株亚系排列不规则，大小不均，形态呈三角形、多角形及多核现象。透射电镜显示：MG63细胞膜平滑，粗面内质网较丰富;MG63/DXR细胞株亚系细胞表面突起增加，粗面内质网丰富，胞质内可见髓样小体、溶酶体及大量糖原池。(4)MG63细胞与其多药耐药细胞株亚系MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100细胞生长曲线相近。(5)细胞周期分析显示MG63、MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100细胞G0/G1期分别为86.34%、83.67%、78.11%、68.81%;G2/M期分别为5.92%、7.45%、7.78%、10.90% ;S期分别为 7.74%、8.87%、14.11%、20.30%;而MG63/DXR与MG63细胞的凋亡指数无显著差异。结论 (1)小剂量DXR为诱导剂建立了人骨肉瘤多药耐药细胞株亚系(MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100)，MG63/DXR、MG63/DXR细胞对于甲氨蝶呤、长春新碱、环磷酰胺产生不同程度交叉耐药。(2)MG63/DXR细胞株亚系细胞形态、超微结构、细胞周期分布与母系细胞MG63有显著差异，凋亡指数无显著差异。(3)MG63/DXR耐药细胞的存在及其分裂、增殖可能是导致骨肉瘤化疗失败和肿瘤局部复发的原因之一。 【关键词】 骨肉瘤;阿霉素;多药耐药;细胞周期 骨肉瘤是一种好发于长骨干骺端的恶性肿瘤。Rosen〔1〕提出新辅助化疗(neoadjuvant chemoherpy)的广泛应用，使骨肉瘤的5年生存率已达60%以上，但恶性肿瘤化疗后多药耐药(multidrug resistance,MDR)现象仍是影响肿瘤患者化疗疗效和预后的主要因素之一。本研究以人成骨肉瘤细胞株MG63为诱导对象，分析其生物学特性。 　　 1 材料与方法 　　1.1 材料 人骨肉瘤细胞株MG63购自上海 中国 科学 院细胞库。阿霉素(DXR，汕头明治医药有限公司)、DMEM(Gibco)、小牛血清(Calf Serum)(Gibco)、胰蛋白酶(Promega)、EDTA(Promega)、二甲基亚砜(DMSO)(Sigma)。CO2孵箱(SANYO MCO17AIC，日本)、超净工作台(YZ875)苏净集团安泰公司，倒置显微镜(OLYMPUS，日本)。 　　1.2 方法 　　1.2.1 主要溶液的配制 DMEM溶液：用950 ml去离子水溶解DMEM粉末13.4 g，加入NaHCO3 3.7 g，HEPES 2.38 g，调pH至7.4，加入青霉素和链霉素，使最终使用浓度分别为100 U/ml和100 μg/ml，使用时加入胎牛血清至终浓度为10%。0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA：称取0.2 g EDTA，用去离子水溶解后，加入2.5 g胰蛋白酶，定容至1 000 ml。 　　1.2.2 MG63培养与传代 MG63骨肉瘤细胞在含有10%小牛血清的高糖DMEM培养液(含青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml)中培养。隔日换液1次。约3 d长满后传代。按1∶3～5传代，继续培养。 　　1.2.3 MG63多药耐药细胞株亚系的建立 DXR加药浓度的确定：取96孔板，每孔接种5×103个细胞，培养24 h后分别加入终浓度为0.1、0.4、1.0、4.0、10.0、40.0、100.0 ng/ml的DXR。继续培养48 h，观察细胞存活情况，确定起始加药DXR终浓度为1.0 ng/ml。传代后将细胞分成实验组和对照组，实验组加入DXR终浓度1.0 ng/ml，24 h后换液，约3 d细胞长满传代。对照组不加DXR，继续培养，约3 d传代。实验组细胞稳定生长后，逐渐加大DXR浓度，依次为4.0、10.0、40.0、100.0