人骨髓间质干细胞分离、培养、分化和鉴定方法的研究.docVIP

　　人骨髓间质干细胞分离、培养、分化和鉴定方法的研究 作者：杨宏辉 蒲晓群 高传玉 李传昶 徐予 陈岩 【摘要】 目的 探讨人骨髓间质干细胞(hMSCs)分离和体外培养的适宜条件，检测其多向分化的能力。方法 应用细胞生物学干细胞培养法、分子生物学干细胞组织工程学等方法研究hMSCs的分离、培养并检测其多向分化潜能。结果 hMSCs增殖能力在一定的范围内(2.5%～20%)随着血清浓度的增加而增大，20%的血清浓度最适宜，其增殖活性在一定种植密度范围内(1～8×104/ml)随种植细胞数量增加而增高，在种植细胞密度为8×104/ml时，细胞的增殖活性最高。所分离、培养的hMSCs是纯的、可长期传代、扩增的稳定的细胞。hMSCs在成脂培养基中有脂肪细胞形成，苏丹Ⅲ染色法将脂肪细胞胞浆染成桔红色。在成软骨培养基中有软骨细胞形成，阿尔新蓝染色法将软骨结节样结构染为深蓝色。在成骨培养基中有成骨细胞形成，Von Kossa染色法显示有黑色矿化结节形成。该细胞在特定的诱导培养条件下具有向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞分化能力，符合判定hMSCs的“金标准”。结论 所分离、培养的hMSCs是纯的、可长期传代、扩增并保持未分化状态的、稳定的细胞，其在体外诱导条件下可向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞分化，是一种具有多向分化潜能的细胞。 【关键词】 间质干细胞;骨髓;多向分化 人骨髓间质干细胞(hMSCs)是一种具有高度增殖和分化能力的成体干细胞。目前己从多种动物体内分离出骨髓间质干细胞，但是尚缺乏间质干细胞特定的表面标志，各实验室分离获取间质干细胞的方法和技术也没有统一的标准〔1〕。目前临床上开展干细胞移植尚有许多困难，造血干细胞、骨髓混杂细胞，粗分离的间质干细胞局部移植均有一定疗效，但是何种干细胞起主要作用尚不清楚;在移植干细胞之前是否需要将其分化为心肌细胞及如何使之分化也不清楚〔1～3〕。本实验采用梯度离心分离后再贴壁培养的方法进行分离、培养hMSCs，然后用观察细胞分化的方法进行鉴定，给后续实验打下良好的基础。在培养的方法、分化和鉴定方面均有创新，有简单、 经济 、实用、有效的特点。 　 　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂 胎牛血清:美国Hyclone;LDMEM培养基为美国Hyclone产品;地塞米松、胰岛素、β磷酸甘油、抗坏血酸等为Sigma公司产品。 　　1.2 hMSCs的分离 3 ml抗凝的幼儿骨髓与等体积磷酸盐缓冲液(PBS)混合,室温,2 000 r/min离心10 min,用PBS冲洗两次。重新悬浮细胞,细胞密度4×107/ml。密度梯度离心法分离细胞,将2～5 ml细胞铺在1.037/ml Percoll溶液上,2 000 r/min离心30 min,收集中间相为有核细胞。将细胞悬浮在hMSCs培养基中(低糖DMEM+15%胎牛血清培养基)，细胞密度4×106/ml。 　　1.3 hMSCs的原代及传代培养和纯化 以4×106/ml的细胞密度接种到骨髓间质干细胞培养基中，含100 IU/ml青霉素和100 μg/ml链霉素。置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。72 h第一次换液，此后每4天换一次培养基;细胞至90%汇合时,用0.25%胰酶/EDTA消化,传代培养。重复上述操作,进行传代扩增,依次标记为P1、P2、P3等。贴附于塑料培养瓶表面的细胞被认为是hMSCs。 　　1.4 不同浓度胎牛血清对骨髓间质干细胞生长的影响 按8×104/ml的密度将P1代细胞种入96孔培养板中,分别加入以下浓度的胎牛血清:3%、5%、8%、10%、13%、15%、18%、20%、23%、25%、30%,每个浓度种6孔。培养48 h后,加入20 μl MTT(浓度为5 mg/ml),37℃ 避光培养4 h;尽量吸掉上清液,加入150 μl二甲基亚砜,室温振荡10 min,置酶标仪上570 nm处读取D570值,以PBS作空白对照。 　　1.5 不同种植细胞密度对骨髓间质干细胞生长的影响 按以下密度(×104/ml):3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0,将P1代细胞种入96孔培养板中,每种密度种6孔。培养48 h后,加入20 μl MTT,37℃避光培养4 h,吸掉上清液,加入150 μl二甲基亚砜,室温振荡10 min,置酶标仪上570 nm处读取D570值,以PBS作空白对照。 　　1.6 骨髓间质干细胞向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞诱导分化和鉴定 培养P5代细胞培养24 h后,分别在培养体系中加入成脂培养基〔10-8mol/L地塞米松+0.25 nmol/L 3异丁基1甲基黄嘌呤(IBMX)+66 nmol/L胰岛素〕(4 d换液一次,维持22 d),