Mt-GFP融合基因转化及不同亚细胞定位的GFP在.PDFVIP

中国科技论文在线 Mt-GFP融合基因转化及不同亚细胞定位的GFP在 柑橘不同组织部位的表达比较 徐世晓，谭彬，李鼎立，郭文武* 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，湖北武汉(430070) * E-mail：guoww@ 摘 要：绿色荧光蛋白基因（gfp）是转基因研究的热门工具之一。柑橘遗传转化中，可 以根据GFP的表达，在早期对转化子进行鉴定，同时可在活体细胞中监测外源基因的表达情 况。利用融合蛋白技术，将线粒体上特有的蛋白质靶定位序列（细胞色素氧化酶IV）与GFP 相连，构建融合基因，将之转入细胞后，该细胞内的线粒体即可带上GFP标记。本研究以柑 橘胚性愈伤组织为外植体，用根癌农杆菌介导法进行 m-gfp4-coxIV 融合基因的转化，共获 得来自不同转化事件的细胞系24个，其中国庆1号温州蜜柑13个，伏令夏橙11个。国庆 1号转m-gfp4-coxIV 基因的愈伤组织荧光表达强且稳定，已用于本课题组细胞融合过程中双 亲线粒体互作的动态研究。伏令夏橙转基因愈伤组织经胚胎发生途径诱导生芽、生根或嫁接 成为完整植株。同时，通过激光共聚焦显微镜观察比较定位线粒体（Mt-GFP）、内质网（Er-GFP） 及细胞质（Cy-GFP）三种不同亚细胞定位的GFP在叶片、茎、根中的表达差异，表明不同亚 细胞定位的GFP表达差异显著，其表达部位特点与GFP融合基因构建目的完全吻合，细胞质 内表达的Cy-GFP荧光强度明显强于定位线粒体Mt-GFP或内质网Er-GFP的荧光强度。 关键词：绿色荧光蛋白；根癌农杆菌介导转化；亚细胞定位；激光共聚焦显微术 中图分类号：查阅《中国图书馆分类法》 1 引言 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP ）是源于海洋生物多管水母属(Aequorea victoria) 的一种发光蛋白，能够自身催化形成生色团并在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光， 且能在活细胞内稳定表达。与传统的GUS报告基因相比，GFP 的荧光反应不需要任何底物及 辅助因子，表达检测简单；GFP 在细胞中呈自主表达，没有细胞种类、位置和种属的特异 性；GFP对受体细胞毒性小，对目的基因表达没有影响[1-4] 。作为一种可以活体观察的报告 基因, 绿色荧光蛋白基因(gfp) 已用于柑橘遗传转化，加快了柑橘原生质体和上胚轴转化体系 的优化和转化机理研究的进程[5-8] 。Guo和 Grosser （2005 ）在体细胞融合中，采用表达GFP 的转基因柑橘作为亲本之一，利用GFP荧光连续监测原生质体融合过程，对再生的杂种细胞 进行观察，筛选杂种胚和再生植株，表明以GFP标记筛选体细胞杂种具有及时、直观、节省 [6] 时间和成本等优点 。 由于GFP分子量小，能与多种不同的蛋白质N端或C端融合而保持其天然蛋白的特性， 可特异地进行蛋白质及细胞器的定位研究[9-13] 。GFP和内质网定位信号HDEL所构建的融合 蛋白，在转化细胞的内质网中可观察到膜质皮层的网状结构。同时，此标记物也促进了生物 [1, 10] 。将GFP与HDEL融合后转化植物，不仅证实 内膜系统的结构、功能和囊泡运输的研究 了植物细胞的内膜系统是高度动态的，而且发现了一些功能未知的新细胞器[14-15] 。Kohler 等将GFP与有特异定位线粒体的酵母细胞色素氧化酶引导肽(coxIV)连接，在烟草线粒体中观 察到GFP 的表达，由此证明烟草中cox IV具有线粒体定位序列的功能[11, 16] 。 - 1 - 中国科技论文在线 根癌农杆菌介导法是柑橘遗传转化中普遍采用的方法，实生苗上胚轴、茎段等因其具有 [7-8,