Wnt77b基因建立软骨细胞退变模型.PDFVIP

·370 · doi 10.3969/j.issn. 1673-4254.2015.03.11 J South Med Univ, 2015, 35(3): 370-374 基础研究 真核表达人真核表达人WntWnt77bb 基因建立软骨细胞退变模型基因建立软骨细胞退变模型 1 1 2 3 ，4 3 ，4 3 ，4 3 ，4 王小军 ，张 浩 ，郑 杰 ，庞 坚 ，曹月龙 ，詹红生 ，丁道芳 1 2 3 浙江中医药大学附属湖州市中医院，浙江 湖州 313000 ；上海吉凯基因化学技术有限公司，上海 201203 ；上 4 海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心，上海 201203 ；上海市中医药研究院骨伤科研究所，上海 201203 摘要：目的在真核细胞中表达人Wnt7b 基因并且观察对大鼠原代软骨细胞的退变作用。方法 取出生24 h SD 大鼠关节处软 骨，Ⅱ型胶原酶多次消化后获得原代软骨细胞，取P 1代细胞进行实验。扩增人Wnt7b 基因及克隆至PCDH-GFP 上，转染 PCDH-GFP 和PCDH-Wnt7b 至293ft 细胞中，48 h 后收集细胞上清及转染细胞，Western blot 鉴定Wnt7b 在293ft 细胞中的表 达。收集的上清分别稀释10倍和50倍培养大鼠软骨细胞，24 h 后观察细胞形态并收集细胞蛋白和抽提RNA ，Western blot 和定 量PCR 检测软骨退变指标MMP 13、MMP3、Ⅱ型胶原、A-can、ADAMTS5、Col Ⅹ和SOX9 的表达。结果 成功克隆人Wnt7b 基 因至PCDH-GFP 载体上且在293ft 细胞中得到有效表达。含Wnt7b 培养基干预软骨细胞24 h 后，软骨细胞形态由原来的多角形 变成长梭形，Wnt7b 处理组软骨细胞MMP 13和MMP3 表达显著上调，Ⅱ型胶原的表达下调。PCR 结果表明A-can 和Sox9 表达 下降，Col Ⅹ和ADAMTS5表达增强。结论 有效在真核细胞中表达Wnt7b 基因并且促进大鼠软骨细胞退变，建立软骨细胞退变 的体外模型。 关键词：Wnt7b 基因；293ft 细胞；软骨细胞；转染；细胞退变 Establishment of a chondrocyte degeneration model by over-expression of human Wnt7b gene in 293ft cell line 1 1 2 3, 4 3, 4 3, 4 3, 4 3, 4 WANG Xiaojun , ZHANG Hao , ZHENG jie , ZHENG yuxin , CAO Yuelong , ZHAN Hongsheng , SHI Yinyu , DING Daofang 1Huzhou Hospital of TCM Affiliated to Zhejing Chinese Medical University, Huzhou 313000, China; 2 Shanghai Genechem Co. Ltd, Shanghai 201203, China; 3 Shis Center of Orthopedics and Traumatology, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM, Shanghai 201203, China; 4Institute of Traumatology and Orthopedics, Shanghai Academy of Tra