2013-2分子生物学实验.doc

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达1. 构建重组质粒（ ET-28α-GFP）： BamHⅠ.NdeⅠ酶切 回收 用同样的酶切DH5α（ET-28α）获得载体片段连接 获得重组质粒2. 导入与表达： 重组质粒 转化DH5α 酶切鉴定 质粒（ET-28α-GFP）转化BL-21（ET-28α-GFP） 诱导表达与检测 获得绿色荧光蛋白 1 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化DH5α） 大肠杆菌感受态细胞的制备1.接种：挑一大肠杆菌单菌DH5αBL21）落放入mL LB液体培养基，37 ℃培养过夜。 2.活化大肠杆菌：取3m新鲜的LB液体培养基加入50-150μ的过夜菌，培养2-3个小时。.将的DH5αBL21）培养液在无菌条件下个于eppendorf管中,冰上放置10 min,然后于4 ℃下000 rpm 离心min； 4.在无菌条件下弃去上清, 转入到一个 eppendorf管中。用0.1 mol/L 的CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置10 min, 4℃下000 rpm 离心 min； 5.加入100μL预冷的0.1 mol/L的CaCl2 溶液缓和菌液，放置冰上。即成感受态细胞悬液可-80 ℃长期保存。pET-28α-GFP 的连接产物（或者质粒） 1.取2个无菌离心管，分别加入100μL DH5α感受态细胞悬液，第1管加μL无菌水，第2管加入质粒DNA溶液μL,轻轻摇匀,冰上放置30 min。 .42 ℃水浴中热激0 s,热激后迅速置于冰上冷却min。 .分别向管中加入00μL LB液体培养基,混匀后在37 ℃100 r/min振荡培养。 .从管1中取00μL涂布于含抗生素的平板上,从管2中取00μL涂布于含抗生素的平板上。正面向上放置约40分钟,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37 ℃培养20小时。eppendorf管mL 玻璃管DH5α培养液μL 10mg/mL的卡那霉素（简称kana），那么终浓度（即工作浓度是30μg/mL） 3质粒DNA的提取分离与纯化 1．5mL DH5α培养液倒入mL的 eppendorf 管中, 000 rpm离心min。 2.弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3.菌体沉淀重悬浮于μL预冷溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),冰浴放置3 min。 4.加入新配制的溶液Ⅱ00μL, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管5次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴3 min。 5.加入20μL预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡3次,使沉淀混匀,冰浴中3 min,1000 rpm离心min。 6.取上清液500μL移入干净eppendorf 管中,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1) 500μL,缓和15 s, 1000 rpm离心min。 7.将水相移入干净eppendorf 管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后，置于冰上10 min，然后1000 rpm离心10 min。 8 .弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入500 μL 70％乙醇洗沉淀一次, 振荡混匀后，10000 rpm离心2 min。 9.吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥得质粒。加灭菌水20μL溶解质粒备用。质粒的限制性内切酶反应分析1.按下表加入其混合液反应物（μ） pET-28α 质粒 I XbaI 10×buffer ddH2O 5 0.3 0.3 1 3.4 2.离心5 s，混匀。 3.37 ℃水浴酶切3-4 h。 4.配制1.0%（M/V）普通琼脂糖凝胶mL。 5. 适当放置冷却，45 ℃左右倒于电泳胶板上，插好梳子。 6.待凝胶凝固好以后，拨下梳子。 7.酶切样品中加入1μ溴酚蓝-GeneFinder混合液混匀，上样。 8.1×TE Buffer，80V(3-4 V/cm)下电泳30 min。 9.荧光激发器观察质粒DNA条带的酶切情况，并照像。质粒反应物 （μ） DBuffer Taq polymerse 14.2 1 1 0.5 1 2 0.3 2.离心5 s，混匀。 3.94℃ 30s 58℃ 30s 30cycles 72℃ 45s 72℃ 2min 10℃ 4.配制1.0%（M/V）普通琼脂糖凝胶mL。 5.适当放置冷却，45 ℃左右倒于电泳胶板上，插好梳子。 6.待凝胶凝固好以后，拨下梳子。 7.样品中加入1μ溴酚蓝-GeneFinder混合液混匀，上样。 8.1×TE Buffer，80V(3-4 V/cm)下电泳30 min。 9.荧光激发器观察质粒DNA条带的情况，并照像。 质粒DNA的