数字PCR革命_JeffreyM_Perkel.pdf

SCIENCE 科学·生命 本栏目由美国《科学》杂志特供 A Science /AAAS Custom Publishing Office feature 数字PCR革命 虽然“大海捞针”这个说法有些老套，但却适用于那些生物清道夫的有哪些信誉好的足球投注网站工作。研究稀有变异生物标记物 的研究人员往往会发现，自己在庞大的背景下寻找微弱的遗传信号，有时甚至在十万或更多的阴性标记中 只存在一个阳性标记。这种现状急需要聚合酶链式反应（PCR），只有这种技术才能捕获那根“定海神针”。 然而标准PCR做不到这点，因为它是定性技术。而实时定量PCR（qPCR）由于缺少必要的准确性和灵敏 性，也无法做到这点。如今出现了第三种日渐流行的选择——数字PCR（dPCR）。通过将十万个分子离散 在大量的个体反应中，数字PCR让稀有阳性标记的发现之旅变得出奇的容易。 Jeffrey M. Perkel / 文 高大海 姜天海 / 译 “数字PCR”概念的提出，是为了更好地鉴定稀有的癌突变。 美国约翰·霍普金斯大学 Ludwig 一方法是为了更好地鉴定稀有的癌突 你从单分子开始时，（反应）要么是 中心联合主任 Kenneth Kinzler 与同事 变。“你能得到的最灵敏的（检测） 100% 的突变，要么是 100% 的野生型， Bert Vogelstein 一起首先提出了“数 是来源于对单分子的观测，我们的点 这使得从野生型中区分出肿瘤变得更 字 PCR”的概念，二人表示研发这 子正是来源于此。”Kinzler 解释说，“当 加容易。” 科学新闻 SCIENCE NEWS 72 SCIENCE 科学·生命 当然，仅仅使用标准 PCR 也能 信号的计数转换为一个绝对值。 如此），他们将两种荧光探针进行杂 找到非常稀有的变异事件。毕竟 PCR Kinzler 将这一过程比作桑格测 交，一种作为对照应该一直杂交，第 擅长从分子的大海中捞针。理论上， 序。在单个管中对 100 个模板分子的 二种是仅能与野生型序列结合，并读 在正确的引物和循环条件下，PCR 混合物（其中有一个是突变的）进行 取结果。仅有超过 100 个孔具有基因 反应能够将一个分子的模板 DNA 复 测序会产生一个电泳图谱，其中在突 组 DNA，其中有四个显示出突变。 制成数百万的子代双螺旋，足以克隆、 变位点上的显著信号会是野生型碱 Kinzler 说，这一结果表明数字 测序或者进行凝胶电泳检测。但这一 基。“你甚至基本不会发现，在（信 PCR 是“一种非常强大、可信和准 过程不是定量的，研究者无法用最终 号峰）下存在着一个表示不同碱基读 确的”稀有突变检测方法。但它也是 反应中的分子数目来推断起始样品中 取的小突起，因为它在整个分子混合 劳动密集型的技术，难以扩大。“说 的 DNA 含量。 物中的占比太低了。”但将这些分子 服一个研究生去做这个实验往往是不 实时定量 PCR 通过在运行中量 稀释并将其分布在多重反应中，就能 可能的。”他说。 化反应解决了这一问题。例如，通过 产生出 个野生型信号和一个明显 2003 年，Kinzler 和 Vogelstein 设 绘制随时间变化的荧光强度曲线，研 的突变信号，这就是数字的、绝对定 计了一个称之为“BEAMing”进阶版 究人员能够比较不同样品间给定基因 量的结果。 步骤，它依赖于“珠子、乳化、扩增 的相对表达量。然而实时定量 PCR 数字 PCR 本质上是把弱信号从 和磁力吸附”。BEAM