明胶酶谱法详解.pdf

Zymography Provided by Hsu suo-wen 一。用品 1.细胞培养或者提取组织 2.试剂的配制 （1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶） A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大下确定配制胶的量） 10% SDS聚丙烯酰胺凝胶 5ml（包括） ddH2o 1.5ml 30%储备胶 （0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺） 1.65ml 1.5mol/l Tris（PH 8.8） 1.25ml 10% SDS 50ul 10%过硫酸铵（AP） 50ul TEMED 4ul 1%明胶 0.5ml(or 100ul) (注意：天气如果较冷除 TEMED，其他成分按顺序加完后要置于 37 度温育，最后 加 TEMED) B.浓缩胶的配制-同Western Blot 浓缩胶 3ml ddH2o 2.1ml 30%储备胶 0.5ml 1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.38ml 10% SDS 30ul 10%过硫酸铵 30ul TEMED 3ul （3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液 0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3） （4）4 ×上样缓冲液20ml(不同于 Western) 0.32% Tris-HCL 6.4ml 50mM Tris 0.606g 4%SDS（PH7.2） 8ml 2% SDS 0.2g 16%甘油 3.2 ml 10%甘油 10ml 溴酚蓝 0.024g 0.1%溴酚蓝 0.01g ddH2o 2.4ml(20ml) (10mlsystem) (5) 洗脱液（1L）:2.5% Triton X-100（25ml），50mmol/L Tris –HCl （6.06g）， 5mmol/L CaCl2 （or 10mMol 1.11g），1μmol/L ZnCl2，pH7. 6 漂洗液 （相比洗脱液，少了 Triton）： 50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2， 1μmol/L ZnCl2，pH7. 6 注意：洗脱液不能重复使用，必须现配，尽可能多加洗脱液，温育摇动时注意 Triton 有毒。 （7）孵育液（相比洗脱液，少了Triton，增加了 Brij）：50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 1μmol/L ZnCl2 （不影响PH）, 0. 02% Brij-35（or 0.02%NaN3， W/V,剧毒 ） ,pH7.6 （8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝 R-250，30%or40%甲醇，10%乙酸 （9）脱色液 A、B、C：甲醇浓度分别为 30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为 10 %、 10 %、5% 二：步骤 1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养 24h。 2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中 2000rpm 离心10min，-70℃储存备 用。1h 3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓（或者测定蛋白浓度调整使 所上蛋白总量一致）。与4×上样缓冲液（4%SDS，0.25 mmol/L Tris-HCl，40% 甘油，0.1% 溴酚蓝）按照1∶3混合。 4.配制分离胶和浓缩胶，15ul/孔上样，注意所有操作必须在冰上操作，不能煮 沸。 （根据表达强忍和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS电泳 100v恒 压跑至分离胶和浓缩胶交界处改为 90 毫安恒流，直至溴酚蓝跑出胶外。 （1 小 时左右）。 5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ， 5mmol/L CaCl2， 1μmol/L ZnCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱 2 次,每次 45 分钟,然 后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟, 接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 1μmol/L ZnCl2, 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃ 孵育42h。 6.孵