枯草芽孢杆菌产角蛋白酶的发酵过程优化.pdf

刘文涛 ，等 ：枯草 芽孢杆菌产角蛋白酶 的发酵过程优化 角蛋 白是一种广泛存在于 自然界 中的硬性蛋 1．3 培养方法 白，主要存在于各种动物 的羽毛 、毛发 、蹄足中．角 1．3．1 种子培养 从甘油管中取 5O L菌液于接 蛋 白结构中的二硫键使其具有抗降解性，不会被多 人装有 50mLLB培养基的250mL三角瓶 ．并在 37 数蛋 白酶如木瓜蛋 白酶 、胃蛋白酶和胰蛋 白酶等降 ℃、200r／min下培养 12h。 解口1。角蛋 白酶是专一性降解角蛋 白的一类酶 ，可由 1．3．2 发 酵 培 养 3L全 自动 发 酵 罐 (New 真菌、放线菌和细菌等多种微生物产生回。角蛋 白酶 Brunswick，美 国)：装液量 1．5L，接种体积分数 5％， 的应用领域十分广泛。研究报道 ，角蛋 白可以作为 发酵温度 37℃，通气体积分数 1：1．5，转速400r／min， 饲料添加剂促进家禽类 的生长 ．作为消毒剂可用于 DO关联搅拌转速 ，控制DO保持在 20％．pH用氨 医药行业 ，在制革过程 中可以减少对环境的污染实 水和盐酸控制 ，pH采用两阶段控制策略，即0～6h 现酶法脱毛3[1。除此之外 ，角蛋 白酶在饲料生产 、食 内控制 pH为 7，6h以后控制 pH为8。 品工业生产营养产品以及洗涤剂生产等行业 ，也显 30L发酵罐 (B．Braun，德 国)：装液量 15L，接 示出良好的应用前景。角蛋白酶使得高效率低能耗 种体积分数 5％，发酵温度 37℃，通气体积分数 1： 的利用含角蛋 白的废物成为可能。 1．5，转速 400r／min，DO关联搅拌转速 ，控制 DO保 虽然角蛋 白酶应用广泛 ．但其研究主要集 中于 持在 20％，pH用氨水和盐酸控制，pH采用两阶段 菌种筛选 、重组菌 的构建 、酶学性质等方面4[1，有关 控制策略，即 0～6h时控制 pH为 7，6h以后控制 发酵条件优化方面虽然有一些报道 ，但 由于产量较 pH为 8。 低 ，迄今为止并没有工业化生产的相关报道 。 1．4 测定方法 作者研究室在前期的研究工作 中，筛选获得 了 1．4．1 菌体干重 的测定 取 10mL发酵液置于离 一 株 角 蛋 白酶 高产 菌 株 Bacilluslichenfiormis 心管中，8000r／min离心 10min，弃上清液 ，将离心 BBE11—1．扩增 出其编码角蛋白酶的基因，构建了重 菌体置于 105oC，烘至恒重 ，称量并计算菌体干重 组质粒 pMA5一ker。并在B．subtilisWB600中成功实 (DCW，g／L)。 现了表达。在前期摇瓶培养研究中，对初糖进行 了 1．4．2 角蛋 白酶粗酶液的制备 取一定量发酵液 优化 ．然而即使分批发酵处于较优 的初糖质量浓 于8000r／rain离心 10rain，上清液即为角蛋 白酶活 度 ，最终获得 的细胞量和角蛋 白酶 的产量依然较 性测定液。 低 ，因此如何提高细胞量和角蛋 白酶的产量是本研 1．4．3 角蛋 白酶活力的测定 取粗酶液 100 L， 究的主要 问题 ，其 中采用流加策略是最主要 的方 100 LGly—NaOH 缓 冲液 (pH 9．0)，300 L的 法。首先优化了发酵条件 ．pH和 DO，采用两阶段控 keratin(1g／dL)在 50℃下反应 20min，加入4mol／L 制pH的策略，DO控制在 20％。显著地提高了角蛋 TCA溶液 500 L终止反应 。经 8000r／min离心6 白酶的产量。在此基础上研究 了恒速流加和指数流 min后 ，取上清液 200 L，加入 lmL4mol／L的碳酸 加对角蛋 白酶