棉花不同GbU6启动子截短克隆及功能鉴定.pdf

作物学报 ACTA AGRONOMICA S1NICA 2016，42(5)：675—683 http：／／zwxb．chinacrops．org／ ISSN 0496—3490；CODEN TSHPA9 E—mail：xbzw@chinajourna1．net．cn DoI：10．3724／SP．J．1006．2016。00675 棉花不同GbU6启动子截短克隆及功能鉴定 雷建峰 李 月 徐新霞2 阿尔祖古丽 ·塔什 蒲 艳 张巨松 刘晓东 ， 新疆农业大学农学院 ／新疆农业大学农业生物技术重点实验室，新疆乌鲁木齐830052；新疆巴州农业技术推广中心，新疆库尔勒 84l000 摘 要：U6启动子是 CRISPR／Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件，而使用较短序列 的启动子也 是构建CRISPR／Cas9基因组编辑载体的基本要求之一。将已经克隆的海岛棉 GbU6．5P启动子(长度为 1l66bp)，采用 TransferPCR方法成功地截出6个长度不同的U6启动子，其长度分别为 672、468、358、280、202和 105bp，并分 别构建了6个启动子驱动的GUS融合植物表达载体 。将构建好的6个 GbU6．5Ps：：GUS—pCAMBIA1300与初始克隆的 GbU6．5P：：GUS．pCAMBIA1300植物表达载体一起利用农杆菌真空渗透转化法分别转染棉花花粉。GUS组织化学染 色显示，克隆到的7个不同截短大小的GbU6．5P启动子均能驱动 GUS基因在棉花花粉中转录，棉花花粉被染成蓝色 但颜色深浅存在显著差异。结果显示启动子长度越短，其转录活性越高。而且另外两种棉花 U6启动子 GbU6．1P和 GbU6．7P也表现出类似的结果。本研究克隆了3个短小的、在棉花花粉细胞中具有转录功能的GbU6启动子。结果 显示更短的U6启动子具有更高的转录活性，而且这一特点在不同U6启动子上具有共性。这预示着使用更短 U6启 动子不仅符合构建CRISPR]Cas9基因组编辑载体的要求，而且会提高sgRNA的转录水平，进而可能提高基因组编辑 效率。 关键词：棉花；GbU6启动子；截短克隆；真空渗透；棉花花粉 CloningandFunctionalAnalysisofDifferentTruncated GbU6Promotersin Cotton LEIJian—Feng ，LIYue，XU Xin—Xia2 AERZUGULI ·Tashi，PU Yan ，ZHANG Ju．Song，and LIU ， Xiao．Dong1， CollegeofAgronomy,XinjiangAgriculturalUniversity,LaboratoryofAgriculturalBiotechnologyofXinjiangAgriculturalUniversiyt,Ummqi 830052，China；CenterofBazhouA culturalTechnologyPromotion，Korla841000，China Abstract：U6promoterisanimportantelementforthetranscriptionofsgRNA intheCRJSPR／Cas9genomeeditingsystem ． Usingashortpromoterisalso oneofthebasicrequirementsofrtheconstruction ofCRISPR／Cas9 genomeeditingvector． AccordingtothesequenceofGbU6．5Ppromotercloned sixdifferenttruncatedU6promotersweresuccessfullyclonedusing TransferPCRmethodna dtheirlengthwere672，468，358，280，202，and 105bp，respectively．Togehterwiht GbU6-5P：：GUS— pCAMBIA1300．GUSfusionexpressionvectorsdrivenbycorrespondingtruncatedpromo