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不同浓度葡萄糖对MG63细胞株TRAIL表达的影响 来源：彩超探头  【摘要】 目的： 观察不同浓度葡萄糖环境下人成骨肉瘤MG63细胞株肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及其护骨素（OPG）、护骨素配体（OPGL）的表达，探讨糖尿病骨质疏松症的发病机制. 方法： 用不同浓度葡萄糖(5.5, 16.7, 33.3 mmol/L)分别刺激培养的MG63细胞24 h， RTPCR法检测TRAIL， OPG， OPGL mRNA的表达，免疫组织化学法检测MG63细胞中TRAIL的表达及分布. 结果： 葡萄糖对MG63细胞中TRAIL， OPGL mRNA的表达，均按照对照组、5.5 mmol/L组、16.7 mmol/L组、33.3 mmol/L组顺序递增（P＜0.05），OPG mRNA的表达按照此顺序递减（P＜0.05）. 33.3 mmol/L组TRAIL mRNA的水平明显高于对照组［(1.004±0.070) vs (0.740±0.023), P＜0.05］, TRAIL免疫反应阳性物质密度也明显高于对照组. 结论： 高糖环境可能导致成骨细胞中TRAIL和OPGL表达增多，OPG的表达减少，这可能是糖尿病骨质疏松症的重要发病机制之一. 　　【关键词】 葡萄糖；MG63细胞；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 0引言 糖尿病易并发骨质疏松症已被公认, 糖尿病对骨代谢的影响主要表现为骨吸收增加,骨形成减少与缓慢,使骨矿物质含量减少和骨质疏松［1］. 确切的细胞机制尚未阐明. 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand, TRAIL）是新发现的肿瘤坏死因子超家族的成员，可表达于人体的许多组织，对许多肿瘤来源的细胞具有很强的杀伤作用［2-3］，可介导病毒引起的凋亡［4-5］，并在一些自身免疫疾病中起作用［6］. 但在糖尿病骨质疏松发病中是否起作用，目前少见报道. 我们观察不同浓度葡萄糖环境下具有人成骨细胞表型特征的MG63细胞株中TRAIL及其护骨素（osteoprotegerin, OPG）、护骨素配体（osteoprotegerin ligand, OPGL）的表达情况, 进一步探讨糖尿病骨质疏松症的发病机制. 1材料和方法 1.1材料第106代MG63细胞株由中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所惠赠；MEM培养液(Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)；牛血清白蛋白、Trizol试剂盒（Gibco公司）；逆转录反应试剂盒（Promega公司）；PCR扩增试剂盒和DNA梯度Marker（TaKaRa公司）；引物由北京三博远志公司合成. 鼠抗人TRAIL mAb（本校免疫学教研室）；生物素标记的羊抗鼠IgG抗体（宝泰克公司）；ABC复合物（华美生物工程公司）；DAB（Sigma公司）. 　　1.2方法 1.2.1细胞培养将第106代MG63细胞株以5×108/L密度接种于培养瓶或制成单细胞悬液接种于预先放置4张7 mm×22 mm盖玻片的培养皿中,用含100 mL/L胎牛血清、50 mg/L维生素C的无酚红MEM培养液,于37 ℃, 50 mL/L CO2条件下培养,2 d 换液1次. 　　1.2.2干预试验接种于50 mL细胞培养瓶的MG63细胞达60%~70% 汇片，行细胞爬片的MG63细胞贴壁后即分别换含1 g/L牛血清白蛋白的无血清MEM培养液培养3 h,再分别用含不同浓度葡萄糖的MEM培养液干预,分为4组： 培养基对照组；5.5 mmol/L组；16.7 mmol/L组；33.3 mmol/L组. 干预24 h后,抽提细胞总RNA行RTPCR操作及免疫组化检测. 以上各组实验均独立重复5次. 　　1.2.3RTPCRTrizol抽提MG63细胞总RNA. 取2 μg总RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA，再取1 μL cDNA行PCR扩增OPG， OPGL， TRAIL基因，以βactin基因为内对照. OPG上游引物： 5′AGTGGGAGCAGAAGACATTG3′，下游引物： 5′ATTGGACCTGGTTACCTATC3′，扩增长度为268 bp；OPGL上游引物： 5′GCGTCGCCCTGTTCTTCTAT3′，下游引物： 5′TTGGTGCTTCCTCCTTTCAT3′，扩增长度为598 bp；TRAIL上游引物： 5′GGCATTCATTCCTGAGCAACTT3′，下游引物： 5′GATCTCGTGATCTACCCACCTT3′，扩增长度为908 bp. 反