EMSA凝胶阻滞实验操作方法.pdf

Electrophoresis mobility-shift assay (EMSAs). --By David. He Section 1 : Purpose and Principle Purpose：EMSAs，gel shift （凝胶阻滞实验），是体外检测蛋白质与DNA 相 互作用的基本实验。 Principle：蛋白质与DNA 相互作用后，增大了DNA 的分子量，在电泳场 中的电泳速度会比没有结合蛋白质的DNA 慢，于是出现 shift 现象，于是我们 通过shift 的能力判断DNA 与蛋白质是否存在相互作用以及作用的强弱。 Section 2 : Procedure and materials Procedure：（Reaction – Electrophoresis – Dyeing - Imaging ） （1） 首先准备纯度达到要求的蛋白质，以及想要去研究的 DNA 片段； （2 ） EMSA 的反应体系为20μL, DNA 的用量在20nM ，蛋白质的用量则根 据自己的蛋白质而定； （3 ） 反应的缓冲液如：DTT 、Mg2+ 、ATP 、甘油等等根据自己的蛋白加入； （4 ） 蛋白质与DNA 的最适反应温度与该蛋白所在的菌体的最适温度一致； （5 ） 将蛋白质、DNA 与缓冲液分别加入PCR 管，最适温度反应，时间一 般为30min ； （6 ） 反应完后，加入 6 X DNA Loading dye ，点样，6 % 非变性胶，0.5xTBE 电泳缓冲液电泳 120-180V 均可； （7 ） Gel-Red 染色，染色10-20min ，然后清水中漂洗10-20min ，image lab 成像。 （8 ） 成像步骤： （1）打开Bio-Rad 成像仪，点击image lab 进入操作界面； （2 ）点击新建 – 核酸凝胶 – GelRed ； （3 ）点击运行实验协议 ，务必使用UV tray ； （4 ）出现上述界面后，即开始成像，请勿打开成像仪的门， （5 ）成像完成后，点击左侧的图像工具 ，对图像进行编辑，点击 对 曝光度进行编辑； （6 ）点击文件，保存，保存一份 .scn 格式的原始文件，可以在软件上对图像进 行更改，然后点击导出，导出以便发布； （7 ）导出一份JPG or TIF 格式的图像。 Materials： （1） 纯化的蛋白，DNA 片段； （2 ） 反应缓冲液：依据蛋白质的特征，各自加入； （3 ） 恒温箱、置胶板、蛋白电泳槽、电极； （4 ） 0.5 x TBE 电泳缓冲液（5 x TBE 稀释即可）； （5 ） 6 % native page 配方 （10ml ）： 成分 体积 ddH O 6 ml 2 30 % 丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺 2 ml 5 x TBE 2 ml 10 % APS 70μL TEMED 10μL （6 ） Gel-Red dye，首先将管壁 Spin 一下，然后取10μL Gel-Red 加入5ml