ion torrent建库流程.pdf

新一代测序平台文库制备 技术简介 Ion Torrent PGM Ion Torrent PGM 基于半导体芯片的高通量测序技术 Ion PGM技术原理 • 使用了一种布满小孔的高密度半导体芯片， 一个小孔就是一个测序反应池 • 当DNA 聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的 DNA链上时，会释放出一个氢离子，反应 池中的pH发生改变，位于池下的离子感受 器感 受到信号，把化学信号直接转化为数 字信号，从而读出DNA序列 Ion PGM技术原理 Ion PGM技术特点 – 简单：基于半导体技术测序原理，不用荧光、 化学发光和酶级联反应；消耗样本少； –快速 ：从文库构建到数据产出只需2天，上机测 序只需2 ～3.5 小时； – 灵活性：可满足不同通量的测序需求： 314 TMChip （＞10Mb/run），316 TMChip （＞ 100Mb/run），318 TMChip （＞1000Mb/run ，今 年年底或明年年初推出）； – 准确性 ：99.97% Ion PGM应用特点 • Ion PGM 的芯片决定了待测样本的通量，通 常根据不同的需要选择不同的芯片，最高 通量在1G左右。因此，PGM在体细胞突变 测序、De novo 测序、小RNA和基因表达研 究、ChIP-seq、农业SNP应用等方面有着不 少的应用范围。 Ion PGM技术优势 • 不需要激发光、CCD成像仪或任何的荧光 标记； • 能直接并快速“读”出DNA序列； • 是小规模测序项目的最佳选择。 Ion PGM工作流程 Ion PGM 文库制备 • 扩增子测序 ：Ion Torrent被大量用于扩增子 测序。用户可以针对目标基因序列，扩增 出大片段PCR产物，等量混合后，进行随机 断裂，进行常规DNA 文库构建。 • FFPE样品文库构建 ：RNA gene expression profiling • 血清游离DNA 文库构建：Pico DNA library construction Gnomegen DNA建库在Ion PGM 扩增子测序方面的应用 • 准备流程 ：gDNA → large PCR products → normalization → mix → fragmentation • 建库流程 ：DNA Seq work flow （和常规 DNA 文库构建相同） • 测序流程 ：上机 → 测序 → 分析 Gnomegen RNA Profiling建库在 Ion PGM平台上的应用 • 应用实例： -人类及其它复杂程度高的转录组表达谱分析； - FFPE等RNA 高度降解样品分析。 • 特点： - 单管反应，一天工作流程； - 起始总RNA 的量只需1ng ； • 优势： - 相同转录水平下数据量需求少； - 相对于全转录组信息来说投入资金少； - 相对于微阵列分析技术来说覆盖更广。 Gnomegen RNA Profiling建库流程 （表达谱测序） Fragmented RNA AAA 5’ Adaptor ligation 5’ Adaptor TTTTTT Reverse RT Primer Transcription