生物常用原理技术总结.doc

生物常用原理技术总结 篇一：生化原理总结 第一部分 基因工程 1基因工程（genetic engineering）：是利用DNA重组技术，将目的基因与载体DNA在体外进行重组，然后把这种重组DNA分子引入受体细胞，并使之增殖和表达的技术 基因工程可以改变生物原有的遗传特性；获得新品种；生产新产品 2基因工程的基本步骤 a. 取得符合人们要求的DNA片段（目的基因的获取） b. 目的基因与载体连接 c. 重组基因转化进入宿主细胞 d. 目的基因（重组细胞）的检测与鉴定 3获取目的基因：a从天然来源获取目的基因– 限制性内切酶 b人工合成目的基因– 寡核苷酸合成技术– 聚合酶链式反应（PCR）c目的基因的分离与收集– 核酸凝胶电泳 4构建基因表达载体 a基因表达载体– 质粒、病毒、混合型载体b基因的拼接– DNA连接酶c基因的改造– 定点突变技术 5将目的基因导入受体细胞 a确定重组载体DNA序列的正确性– DNA测序技术b外源基因导入宿主细胞的方法 – 转化、转染、转导 6目的基因的检测与鉴定a目的基因是否转入宿主细胞–致死性及蓝白斑筛选–Southern印记法b目的基因是否转录出了mRNA – Northern印记法c目的蛋白质是否表达–SDS‐PAGE电泳结合肽指纹谱测序 7限制修饰系统: A 限制系统：限制性核酸内切酶（–生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶–它可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息） 分类：I型： ? 兼具限制、修饰两种功能 ? 具有特定的识别位点，但没有特定的切割位点，一般切割位点距识别位点400bp以上，并对识别位点进行随机切割 ? 很难形成稳定的特异的切割末端，在基因工程中没有应用价值 II型： ? 其限制-修饰系统由两种酶组成：一是限制酶；二是独立的甲基化酶，它能修饰与限制酶识别位点相重叠的序列 ? 有特定的识别序列，长度一般为4～6nt，且呈二重对称 ? 有特定的酶切位点，能在其识别序列的特定位点处对双链DNA进行切割，产生特定的酶切末端（II型：识别位点长度与出现频率；识别序列的频率=1/4N ? Sau3A(4bp)=1/44 256 bp ? EcoRI、PstI(6bp)=1/46 4096 bp ? NotI(8bp)= 1/48 65536 bp (rare cutters) ） III型： ? 兼具限制、修饰两种功能 ? 有特异的识别位点和切割位点，切割位点距识别位点3端24～26bp ? 因为已发现的Ⅲ型限制性内切酶种类太少，基因工程中不常用 B 修饰系统：DNA甲基化酶（以大肠杆菌为例） ? dam甲基化酶：在5‐GATC‐3序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基 ? dcm甲基化酶：在5‐CCAGG‐3或5‐CCTGG‐3中的胞嘧啶C5位置上引入甲基 8限制酶切反应的关键因素：底物DNA的纯度和物理特性；反应系统；反应体积；孵育(保温)时间和温度 限制酶的第二活性：星活性 (star activity)是指严格典型的识别序列特异性被放宽而导致在DNA内产生附加的切割，在该酶名称的右上角加星号表示之。如EcoRⅠ的识别序列为GAATTC，EcoRⅠ*的识别序列放宽为AATT。造成星活性的因素有：甘油浓度、离子强度、pH值、有机溶剂、二价阳离子、酶与DNA之比 保护碱基：内切酶在切断DNA时，如果酶切位点在末端时，外侧必须还有若干个碱基内切酶才能发挥作用，外侧这几个碱基就叫做保护碱基（不同内切酶保护碱基个数不同） 9限制性内切酶使用注意事项：同裂酶；特异性甲基化及星活性；合适的酶浓度；多酶切提高效率 10寡核苷酸合成技术：由于高效、快速以及起始材料非常稳定，脱氧核苷亚磷酰胺(Phosphoramidite)方法成为寡聚核苷酸化学合成的首选（通过受保护的亚磷酰胺核苷的3′端磷酸基团与固定在载体上的核苷酸5′末端羟基的酯化偶联一个碱基实现逐步合成；合成方向为3′ → 5′，与酶促反应相反） 11PCR的基本步骤 变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链 退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对 延伸(Extension)：DNA模板‐引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链 12带电荷物质在电场中的趋向运动称为电泳 核酸电泳通常在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行，浓度不同的琼脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子筛网孔大小不