大鼠原代肝细胞培养方法的建立_倪慧.pdf

网络出版时间：2013-06-25 09:06 网络出版地址：/kcms/detail/34.1278.S0906.150.html 动物科学 现代农业科技 圆园13年第 12期 大鼠原代肝细胞培养方法的建立 倪 慧 王玲玲 韩 涛 刘学忠* 渊扬州大学兽医学院袁江苏扬州 225009冤 5 摘要 体外培养大鼠原代肝细胞的方法很多袁但均存在一些缺陷遥对胶原酶灌流法进行改良袁采用细胞密度为6伊10 个/mL袁细胞生长 状态好袁既能保证细胞活率袁又能满足下一步试验要求遥用胰酶代替胶原酶进行肝脏灌注袁胰酶最适浓度为0.18%袁且灌流时维持最适温度 37益袁分离得到的肝细胞存活率大于90%袁且纯度很高袁是一种操作简便尧细胞存活率和纯度较高的新的大鼠原代肝细胞体外培养方法遥 关键词 细胞培养曰原代曰大鼠 中图分类号 + Q813.1 1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739渊2013冤12-0226-02 [1-4] 体外培养大鼠原代肝细胞的方法很多 袁常用的有直 浸润的纱布袁并在灌流过程中用37益的PBS不断浸润袁保 接剪切法[5] [6] [7-8] 尧组织块消化法 和两步胶原酶灌流法 等遥由于 持肝脏温度利于胰酶的消化曰在肝门静脉的近心端和远心 肝细胞体外培养增殖能力差袁原代培养的细胞存活率不高袁 端分别结扎缝合线袁留置针插入门静脉袁缓慢抽出针芯袁若 [9] 故在一定程度上阻碍了肝细胞体外模型的广泛应用 遥直接 回血袁说明插入正确袁将缝合线扎紧袁将输液器连接留置针袁 剪切法和组织块消化法所分离肝细胞杂质较多袁细胞纯度 剪开下腔静脉近心端袁用37益预热D-Hanks液以流速为25 不高袁酶消化反应不易控制袁且过多的结缔组织直接影响细 mL/min开放灌流约12min袁冲掉肝脏内的血细胞袁待肝脏变 胞的正常生长等袁不利于细胞生物学和分子生物学的进一 为土黄色后袁改用37益尧含0.18豫胰酶的D-Hanks液以流速 步研究遥胶原酶灌流法分离的肝细胞数量多且活力好袁是分 为25mL/min继续灌流7min袁肝脏由土黄色变为白色曰取下 离大鼠原代肝细胞的经典方法[3]袁但由于操作方法较为复 完整的肝脏袁用含双抗渊100kU/L青霉素和 100kU/L链霉 杂袁限制了该方法的广泛应用遥该试验对胶原酶灌流法进行 素冤的PBS清洗3次袁放入含双抗和 1豫BSA-Hanks液中终 了改良袁试图建立一种操作简便尧细胞存活率和纯度较高的 止胰酶消化袁并用眼科镊分离肝组织袁去除肝包膜及血管等 新的大鼠原代肝细胞体外培养方法遥 结缔组织袁收集肝细胞悬液袁分别用 100尧200 目的筛网过滤 1 材料与方法 肝细胞悬液袁离心600r/min袁5min袁去除上清液袁用1豫BSA- 1.1 试验材料 Hanks液重悬沉淀袁500r/min离心5min袁