2010＿11基因工程的基本操作程序〔动画〕上课课件.ppt

基因表达载体的构建——核心 启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，终获得蛋白质 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录 2、导入动物细胞 （1）方法：显微注射法 （2）程序： 基因工程操作动画 基因探针 基因文库的构建模式图 * DUCK179制作 基因工程的基本操作程序 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 操作过程 目的基因的检测与鉴定 一、目的基因的获取 ☆目的基因主要是______________________ 编码蛋白质的基因 请举出三个以上的例子 ☆获取目的基因的常用方法有哪些? 1、从基因文库中获取(从自然界已有物种分离) 2、利用PCR技术扩增 3、人工合成 请阅读P8、9第一和二两段 一、目的基因的获取 什么叫基因文库？ 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，该受体菌群称为基因文库 （一）从基因文库中直接获取 一、目的基因的获取 （一）从基因文库中直接获取 1.基因文库：概念见P9。……的受体菌群体 2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类 种类 基因组文库：含有一种生物的全部基因 部分基因文库：含一种生物的部分基因， 如：cDNA文库 3.建基因文库的目的 为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。 4、基因文库的构建 （1）基因组文库的构建 提取某生物 全部DNA 用适当 限制酶切割 许 多 DNA片段 与载体连接 导入受体菌群 该生物 基因组文库 （每个受体菌含有一段不同的DNA片段） （2）cDNA文库的构建——mRNA反转录形成 mRNA （某一发育时期） 逆转录酶 杂交双链 核酸酶H 单链DNA DNA聚合酶 双链DNA (cDNA) 与载体连接 导入受体菌群 该生物 cDNA文库 1、 概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术。 又叫做体外DNA扩增技术。 通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 2、原理： DNA复制 （二）利用PCR技术扩增目的基因 IMN 变性 复性 延伸 四种脱氧核苷酸(dNTP) 一对引物： 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） 模板DNA( 需含有目的基因 ) 4、条件： 一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补 一段已知的目的基因序列，以便根据这一序列合成引物 3、前提： 温度控制 5/ 3/ G—G T—C 3/ 5/ G—A C—C 5/ 3/ 引物Ⅱ G—G 变性 复性 延伸 1、变性(90 ---95 ℃)：目的基因DNA受热变性，解链为单链； 2.复性（55--60 ℃）：引物与两条单链通过碱基互补配对原则结合； 3.延伸（70---75 ℃）：在DNA聚合酶（Taq酶）作用下，从5′端→3′端进行延伸。 5/ 3/ A—G 引物Ⅰ 5、扩增过程： 利用PCR技术扩增目的基因（动画演示） PCR技术扩增过程 a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下， 断裂，形成_______ b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，从引物的______________________延伸，合成与模板互补的________。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 5′端→3′端 （三）通过DNA合成仪用化学方法人工合成 DNA合成仪 蛋白质的氨基酸顺序 mRAN 核苷酸序列 基因（DNA）的核苷酸序列 目的 基因 推测 推测 合成 当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。 DNA合成仪 二、基因表达载体的构建 1、构建目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 —— 核心 目的基因 1.用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。 2.用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。 2、构建过程： 3. ___________将切下的目的基因片段插入质粒的______处，形成了一个重组DNA分子（基因表达载体、重组质粒） 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连