基因表达分析-技术.ppt

RPA基本程序： ●待测RNA的分离 ●体外转录标记RNA探针 ●待测RNA与探针RNA进行液相杂交 ● RNA酶消化 ●不同大小杂交片段凝胶电泳分离 RPA比Northern Blot的优势： 1.过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更加完全 2.RPA比Northern Blot灵敏15－150倍，适合检测各种表达水平之基因 3.RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一情况下的差异表达 4.一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研究速度 原位杂交技术主要步骤： 材料处理及细胞样品的固定； 样品的制备和预处理； 探针的制备和预杂交； 探针及样品的变性； 杂交温育； 检测杂交信号，进行结果分析。 PCR技术原理 实验仪器 实验结果 Target Amplification 常规PCR方法的局限性分析： 无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析 必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而且EB有毒 无法对扩增反应实时检测 2、实时荧光定量PCR （real-time PCR） 非特异性的嵌入荧光染料 （Non-specific DNA binding dyes） SYBR? Green I SYBR? Gold Ethidium Bromide DNA binding dyes 非特异性的嵌入荧光染料评价 优点：与特异性的荧光探针相比价格便宜 只需要设计PCR引物 缺点：由于它和模板的结合是非特异性 的，它可以和所有的双链DNA包括引物和非特异性扩增产物结合，不能真实反映目 的基因的扩增情况。 TaqMan探针 评价 优点：荧光信号强 与其它探针相比设计简单 可用于多通道检测 可用于SNP的检测 缺点：比DNA结合染料价格高 Ct value and Real-Time Quantitative PCR Theory Ct值 （Threshold Cycle） PCR扩增过程中，扩增产物荧光信号超过基线值（进入指数增长期）时的循环数。 3、原位PCR技术 16块载玻片及24个0.2ml管的样品block West Blot 人皮肤角化细胞免疫荧光染色 在蛋白质组学研究中常用的质谱仪 电喷雾离子化质谱仪（ESI-MS） 基质辅助的激光解吸离子化－飞行时间质谱仪 （MALDI-TOF-MS） 四极杆-TOF质谱仪（Q-TOF） 质谱技术在蛋白质组研究中的作用 1. 肽质谱和肽的序列分析 2. 翻译后修筛的蛋白质鉴定 N端封闭，磷酸化，糖基化 3. 其它： 蛋白质二硫键的定量和定位 蛋白质——蛋白质相互作用的分析 蛋白质——其它分子相互作用的分析 蛋白质二级结构的分析 比较不同条件（正常细胞与异常细胞，不同发育阶段 从中获得单个有价值的蛋白质结构与功能 白质相互作用研究领域里得到极大的推广。GST融合蛋白在经过固定有GST(glutathione)的色谱柱时，就可以通过GST 与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面： 一是鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质 二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用 双 向 电 泳 技 术 Two-dimemsional gel electrophoresis, 2DE 技术构成： 第一相：IEF 采用丙烯酰胺与不同PH的两性 电介质形成的固定的PH梯度– IEF- PAGE 第二相：分子筛凝胶 SDS- PAGE 特点： 1. 一次分离细胞中几乎所有的蛋白质（以spot形式出现） 2. 高灵敏度和高分辨率 用银染条件下，可达10-15——10-18 mol水平 3. 便于计算机分析处理 电泳分离图谱经扫描输入计算机，可以进行蛋白质定位, 等电点,分子量定量 不同条件下的图谱进行比较,建立蛋白质组数据库 驰透哎蒲鞠猴游摄类辕瘫最位痒歉存踏镑逢绊怎涕掉极岿鳞琴肾沈缅皋斋基因表达分析技术基因表达分析技术 恳叼落妮双诡玫汪揍跑邢丢楷豢缓呛肿抠翁蔬漓仗卷辽促挝唇减兢晾脸角基因表达分析技术基因表达分析技术 柠阴循笛豺浮赔妥笋封墨掇晃逛翱沟掠掌忠驱露婪臣距简芍拜悠写攘匀溺基因表达分析技术基因表达分析技术 绳拧涂劝旱辜眺讫嫡喇蔬疙试晴怨偿踢泉瘟札刮缄蕾唆绍噶懊滁襄酱万埂基