（Molecular Biology）分子生物学 5.pptVIP

* * Θθ：西塔 * * * * * * * 速度太慢20nt/s 酶量太多（每个大肠杆菌中含有约400个DNA polyI分子，大大超过了每条染色体两个复制叉的需要） 有缺陷的大肠杆菌能够照样生存 * 速度出奇的慢。 无任何缺陷 * 复制的主要酶， 大肠杆菌的一种DNA polyIII温度敏感型突变株，这种突变株只能生存在30度以下，当温度上升到45度时，细菌难以生存。因为编码polC基因已失活，使得DNA的复制难以进行。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 6. 真核生物与原核生物DNA复制的比较 (1) 相同点： a. 半保留 b. 半不连续复制 c. 复制过程包括起始、延长和终止三个阶段 d. 要求有相应的蛋白质(如SSB)和酶(如DNA聚合酶)参与 (2) 不同点： a. 真核生物基因组比原核生物大得多，但它复制时每秒结合的核苷酸数比后者少。(50bp/s, 1/20) b. 真核生物有多个复制起点，在一轮复制未完成前，不能进行新一轮复制。原核生物中，只有一个起始点，但复制起点可连续开始新的DNA复制，表现为虽只有一个复制单元，但可能有多个复制叉。 真核生物 原核生物 七、DNA复制的主要形式 1. 环状DNA双链的复制 (1) ?型(大肠杆菌) ?结构 起点 终点 (2) 滚环型（ 噬菌体?x174 ） 是单向复制的一种特殊形式。 (3) D-环型（D-loop） 也是单向复制的一种特殊形式 。 首先在动物的线粒体中发现， 叶绿体DNA也采取这种方式。 过程： 双链环状DNA，两条链的复制起点不同。复制从一个 起点开始，迅速合成一条链的互补链。另一条链被排 开成一游离的单链环（即D-环），直到它的复 制起点才开始它的复制。 D-环 两条链的合成高度不对称 2. 线性DNA双链的复制 复制叉生长方式有单一起点的单向（如腺病毒）及双向（如T7噬菌体）和多个起始点的双向复制（如真核生物）等几种。 本章重点、难点： 基本概念：DNA半保留复制、前导链、后随链、冈崎片段、复制子、复制泡、引发体、复制体等； DNA复制的特点；原核生物DNA复制的过程及其与真核生物DNA复制间的比较；复制过程中涉及到的酶及其功能；端粒的复制。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 2. DNA聚合酶 核酸酶：切除多核苷酸链中磷酸二酯键的的酶。 内切酶：断裂内部二酯键的酶。内切酶作用产生核酸片段。 外切酶：切除末端核苷酸的酶。外切酶从分子的末端切除， 产生单核苷酸。 DNA聚合酶：合成DNA的酶，完成DNA链的延伸。 E. coli 中发现了三种DNA聚合酶： DNA聚合酶I、DNA聚合酶II和 DNA聚合酶III DNA聚合酶只能以脱氧核苷三磷酸（ dNTP）为底物。 (1) DNA聚合酶 I Kornberg于1957年发现，称为Kornberg酶或DNA聚合酶I。 需要DNA模板才能发挥作用。一旦与模板结合，不会马上脱离，而是继续作用，称为持续性，保证了复制过程的连续性。 ?酶活性： A. 5’?3’方向的聚合活性。在模板指导下，以脱氧核苷三磷酸为底物，在 引物的3’-OH末端加上脱氧核苷酸。 B. 5’?3’外切酶活性： a.只能在5’-P末端一个接一个地切除nt；b.能连续地切除多个nt； c.只切除配对的5’-P末端nt；d.既能切除脱氧核苷酸也能切除核苷酸；e.对具有5’-P末端的切口也有活性。 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ C. 3’?5’校正外切酶活性： 从3’-OH开始以3’?5’方向水解核苷酸，起校正功能，保证复制有尽可能高的保真度。 聚合酶功能 5’ 3’外切功能 3’ 5’ 外切功能 用枯草杆菌蛋白酶处理DNA聚合酶I，可获得两个片段，大片段的分子质量约76 kDa，保留聚合酶活性和3’ 5’外切核酸酶活性，又叫Klenow片段。 小片段的分子质量约34 kDa，具有 5’ 3’外切核酸酶活性。 ? Klenow片段 ? 应用 很多实验表明DNA聚合酶I不是大肠杆菌复制中主要的合成酶，而是在去除RNA引物、DNA损伤修复以及DNA体外标记中起重要作用。 (2) DNA聚合酶 II 具有5’?3’方向的聚合酶活性和3’?5’外切酶活性。其生理功能还不清楚。可能主要在DNA损伤修复中起作用。 (3) DNA聚合酶 III a.全酶由7