（Molecular Biology）分子生物学 2016年实验课.pptVIP

分子生物学实验 李娜 理科楼A706 lina2014@njau.edu.cn 应用植物基因组实验室 实验内容 植物基因组DNA的提取 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR） 琼脂糖凝胶电泳 实验一、植物基因组DNA的提取 实验目的：掌握十二烷基磺酸钠法提取植物基因组DNA的原理和方法 实验难点：如何保证产量、质量 植物细胞结构示意图 细胞壁 细胞膜 原生质体 细胞质 液泡 果胶、纤维素 膜脂、膜蛋白和糖类. 核糖体、多种酶类、中间代谢物、大分子单体等 细胞核 糖、蛋白、磷脂、植物碱等 实验原理 利用物理或化学方法破碎植物细胞壁。 利用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）或十二烷基磺酸钠（SDS）等离子型表面活性剂解聚细胞膜和核膜蛋白。 酚或氯仿、异戊醇等有机溶剂使蛋白质变性，抽提液分相。通过离心可以从抽提液中去除细胞碎片和大部分蛋白。 在上清液中加入乙醇或异丙醇将DNA析出。 实验材料和试剂 实验材料：植物叶片 实验所需试剂： DNA提取液：0.1M Tris-Hcl (pH8.0)，0.05M EDTA (pH8.0) ，1.25% SDS， 0.5M NaCl，3.8g/L 亚硫酸氢钠 氯仿、异戊醇、无水乙醇，TE等 Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏。 EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNA酶和其他一些酶的活性。 SDS离子型表面活性剂解聚细胞膜和核膜蛋白。 NaCl 提供一个高盐环境，降低DNA的溶解度。 亚硫酸氢钠是还原剂，保护DNA在体外不被氧化 实验仪器 研钵 不同型号的eppendorf管 离心机 各种型号的微量移液器 加入提取液 65°C温浴 30-40min 轻微摇晃10-20min 离心 充分干燥 缓冲液储存 加等体积预冷乙醇沉淀 70%乙醇洗涤 离心 吸上清 加入等体积氯仿/异戊醇 实验方法 实验方法 1、取适量的植物幼叶，加入液氮充分研磨。加入DNA提取液，提取液的量以能悬浮起叶片粉末为宜； 2、65°C温浴30-40min，其间每隔5～10分钟颠倒混匀一次； 3、静置、冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇 （24:1），置摇床上轻轻摇晃10-20分钟。10000rpm离心 10min，吸取上清； 4、加等体积-20°C预冷的无水乙醇沉淀； 5、用干净枪头钩出絮状的DNA，置于70%乙醇洗涤，置摇床上轻轻摇晃10-20分钟; 6、挑出DNA吹干，用TE溶解，贮藏待用。 实验注意事项 微量移液枪的使用一定要规范：注意量程；吸取试剂时要注意不要将试剂吸入枪中 叶片磨得越细越好，加入提取液的量一定要合适，水浴时间合适 提取过程中的机械力可能使大分子DNA断裂成小片段，所以为保证DNA的完整性，各步操作均应较温和 由于植物细胞中有大量的酶，对DNA的提取不利，除在提取液中加入EDTA抑制酶的活性外，加提取液时应迅速以免组织解冻，导致细胞裂解，使DNA降解 实验二、聚合酶链式反应-PCR 实验目的：学习和掌握PCR的基本原理和相关实验技术 实验原理： PCR实际上是DNA复制在体外的模拟，是DNA体外合成放大技术，当双链DNA变性为单链DNA后，DNA聚合酶以单链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，利用反应液中的dNTP通过变性、退火、延伸等步骤合成与模板链互补的DNA子链。可用于基因克隆，基因多态性研究，转基因检测，司法鉴定等许多方面。 PCR三大步 1.变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，形成单链。 2.退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成双链分子。 3.延伸(extension)：在dNTPs、 Mg2+ 存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板链互补的子链。 实验试剂、仪器 实验试剂： 模板DNA、 Taq酶、Taq酶10×Buffer、Mg2+、 dNTP、引物、无菌去离子水、无菌石蜡油 实验仪器： PCR仪、微量移液器、微量离心管、微量吸头等 实验方法 PCR反应体系(50ul) 模板DNA：5ul Taq酶10×Buffer：5ul （Mg2+） dNTP： 4ul 引物：正向、反向各1ul Taq酶：0.5 ul 去离子水：33.5 ul PCR反应程序 94℃ 3min 94℃ 30sec Tm℃ 40sec 36Cycles 72℃ 1min 72℃ 5min 4℃ ∝ 变性 延伸 注意事项 防止污染 样品间的污染 PCR体系各组分之间的污染 PCR反应体系（各个成份的比例） 模板浓度 引物特异性 扩增延伸时间 实验三、琼脂糖凝胶电泳