（Molecular Biology）分子生物学 实验课.pptVIP

分子生物学实验 李国强 liguoqiang@ 作物基因组与生物信息研究中心 2013-05-05 实验内容 植物基因组DNA的提取 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR） 琼脂糖凝胶电泳 实验一、植物基因组DNA的提取 实验目的：掌握SDS法提取植物基因组DNA的原理和方法 实验难点：保证DNA的质、量 提取的量 DNA完整性 植物细胞结构示意图 细胞壁 细胞膜 细胞质 细胞核 实验原理 采用物理或化学方法破碎植物细胞壁；利用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）或十二烷基硫酸钠（SDS）等离子型表面活性剂溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，DNA游离出来；随后加入酚或氯仿、异戊醇等有机溶剂使蛋白质变性。由于DNA溶解于水，通过离心可以使提取液分相，去除细胞碎片和大部分蛋白，随后在上清液中加入乙醇或异丙醇将DNA析出。 Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏。 EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性。 NaCl 提供一个高盐环境，降低DNA的溶解度。 实验材料和试剂 实验材料：植物叶子 实验所需试剂： DNA提取液：0.1M Tris-Hcl (pH8.0)，0.05M EDTA (pH8.0) ，1.25% SDS， 0.5M NaCl，3.8g/L NaBisufite 氯仿、异戊醇、无水乙醇，TE等 实验仪器 离心机 各种型号的微量移液枪 研钵 不同型号的eppendorf管 实验方法 1、取适量的植物幼叶，加入液氮充分研磨。将适量叶片粉末转入2ml离心管，加入适量DNA提取液； 2、65°C水浴30-60min，每隔5～10分颠倒混匀一次； 3、静置冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇 （24:1），置摇床上轻轻摇晃20分钟。10000rpm离心 10min，吸取上清液至1.5ml离心管； 4、加等体积异丙醇或-20°C预冷的无水乙醇沉淀； 5、用70%乙醇洗涤DNA沉淀2-3次，置摇床上轻轻摇晃10-20分钟; 6、吹干DNA ，用TE溶解。 实验注意事项 叶片磨得越细越好，加入提取液的量一定要合适，水浴时间合适； 提取过程中的机械力可能使大分子DNA断裂成小片段，所以为保证DNA的完整性，各步操作均应较温和，避免剧烈震荡； 由于植物细胞中有大量的酶，对提取的DNA不利。除在提取液中加入EDTA抑制酶的活性外，加提取液时应迅速以免组织解冻，导致细胞裂解使DNA降解； 微量移液器的使用一定要规范。吸取氯仿等有机试剂或腐蚀性试剂时注意不要将试剂吸入枪中。 实验二、聚合酶链式反应-PCR 实验目的：学习和掌握PCR的基本原理和相关实验技术 实验原理： PCR实际上是体内DNA复制在体外的模拟。当双链DNA变性为单链DNA后，DNA聚合酶以单链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，利用反应液中的dNTP通过变性、退火、延伸等步骤合成新的DNA的互补链，在体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。它是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究，转基因检测，司法鉴定等许多方面。 PCR三大步 1.变性(denaturation)：通过加热使模板DNA双链之间的氢键断裂，形成单链的过程。 2.退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。 3.延伸(extension)：在引物、dNTPs、 Mg2+ 存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。 实验试剂、设备 实验试剂： Taq酶、dNTP、10×Taq酶Buffer、Mg2+、引物、模板DNA、无菌去离子水、无菌矿物油 实验设备： PCR仪、微量移液器、微量离心管、微量吸头（Tip头）等 实验方法 PCR反应体系(50ul) 模板DNA：5ul 10×Taq酶Buffer：5ul Mg2+： 4ul dNTP： 4ul Primer：左右引物各1ul Taq酶：0.5 ul 去离子水：29.5 ul PCR反应程序 94℃ 3min. 94℃ 30sec. 55℃ 40sec. 36Cycles 72℃ 1min. 72℃ 5min. 12℃ ∝ 预变性 延伸 注意事项 防止污染 PCR反应体系（各个成份的比例） 模板浓度 引物特异性 扩增延伸时间 Taq酶（不同的酶对应的PCR程序不同） 实验三、琼脂糖凝胶电泳 实验目的：学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。 实验原理：琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DN