分子生物学（贾海燕）第七章DNA研究技术2.docxVIP

三．基因图谱的构建遗传图谱：指应用遗传学技术（遗传重组）构建的能在基因组上显示基因和其它序列特征位置的线性排列图，反映了基因或标记间的相对距离和顺序。单位：cM物理图谱：指应用分子生物学技术直接分析DNA分子，从而构建的能显示包括基因在内的序列特征位置的图谱，它反映了基因或标记间的实际距离。bp，kb，Mb遗传图谱构建遗传图谱就是寻找基因组不同位置上的特征标记。遗传标记：可以示踪染色体、染色体某一片段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。? 形态标记? 细胞学标记? 生化标记? DNA分子标记所有的标记都必须具有多态性！形态学标记：株高、颜色、白化症等最早建立的果蝇连锁图，就是利用控制果蝇眼睛的形状、颜色，躯体的颜色、翅膀的形状等形态性状作为标记，分析它们连锁关系及遗传距离，绘制而成的。控制性状的其实是基因，所以形态标记实质上就是基因标记。细胞学标记染色体的核型；染色体的带型；染色体的结构变异； 染色体的数目变异优点：不受环境影响缺点：数量少、费力、费时、对生物体的生长发育不利生化标记 ，又称蛋白质标记就是利用蛋白质的多态性作为遗传标记。如：同工酶、贮藏蛋白优点：数量较多，受环境影响小缺点：受发育时间的影响、有组织特异性、只反映基因编码区的信息DNA分子标记简称分子标记指具有相对差异的等位基因的DNA多态性标记，是DNA水平上遗传变异的直接反映。优点：不受时间和环境的限制遍布整个基因组，数量无限不影响性状表达变异丰富，多态性好共显性，能鉴别纯合体和杂合体限制性片段长度多态性RFLP用限制酶酶切基因组DNA时，在同一种生物的不同个体间出现含同源序列的酶切片段长度的差异。人的基因组中大约有10^5个RFLP原因：酶切位点发生变异DNA片段的插入或者缺失确定RFLP的两种方法：Southern hybridizationPCR 酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences,CAPS)随机扩增多态性用随机短引物进行DNA的PCR扩增，若DNA的遗传特性发生变化，PCR产物表现其差异性，经电泳分离后，就可检测出被扩增的DNA多态性。简单重复序列SSR注意：它的利用是因为SSR得两边序列我们知道，然后我们可以设计引物来区别这两个序列人的基因组中大约有5*10^5Simple sequence repeat, SSR, Microsatellite (微卫星)指重复单位相对较小（2-8 bp的基序），由于重复单位数目的变化而形成的多态性。方法：引物需要荧光标记可获得片段的准确长度PCR+平板PAGE电泳PCR+毛细管电泳序列标签位点，STSSequence tag site, STS指序列已知，染色体定位明确，且可用PCR扩增的单拷贝序列单核苷酸多态性 SNP基因组中的某些位点上，有些个体只有一个核苷酸与其它个体不同，这种分散在基因组中的单个碱基的差异就称为SNP。人的基因组中大约有4x106个SNP;绝大多数SNP是双等位基因；有的能形成RFLP，绝大多数不能。检测方法：通过耐扩增突变系统检测SNP（Amplification RefractoryMutation System, ARMS）将SNP位点引入PCR引物3’端的最后一个碱基，直接进行PCR扩增。在严谨的PCR条件下，存在SNP的引物对不能扩增出目的条带。物理图谱遗传图谱的局限性：1. 遗传图谱的分辨率依赖于所得到的交换数目；2. 遗传图谱的准确率有限物理作图的常用方法：1) 限制性作图：在DNA分子上定位限制性内切酶酶切位点的相对位置；2) 荧光原位杂交（FISH）：将分子标记与完整染色体杂交来确定标记的位置；3) 序列标签位点（STS）作图：通过对批量的基因组片段进行PCR和（或）杂交分析，来对短序列进行定位作图。限制性作图（Restriction mapping）限制性作图的基本方法双酶解（double digest）：Key：分析重叠片段部分酶解+完全酶解：比较分析这两种情况下的片段大小。端标记+部分酶解a) 利用放射性的同位素标记DNA的3’端 或5’端b) 部分酶解c) 放射自显影限制性作图的规模受限于限制性片段的大小如果使用的限制酶在DNA上切点相对较少，构建限制性图谱就比较容易。限制性作图更适用于小分子。如果DNA分子小于50kb，通常选用6碱基识别序列的限制性酶来构建限制图谱。对于大于50 kb的DNA分子，可以选用“稀有酶”进行构建。荧光原位杂交（FISH）原位杂交是以标记的DNA分子为探针，检测完整染色体的一种杂交分析方法。序列标签位点作图（STS作图）如果某两个STS标签在基因组上靠的很近，它们同时出现在一个DNA大片段上的概率就会很大，反之就会很小。因此，可以根据两个STS的分离频率来计