分子生物学实验：1 实验一 DNA提取.pptVIP

植物DNA的提取与纯化 DNA extraction and purification 实验一 什么是DNA？ 编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位，是染色体或基因组的一段DNA序列(对以RNA作为遗传信息载体的RNA病毒而言则是RNA序列)。包括编码序列(外显子)、编码区前后对于基因表达具有调控功能的序列和单个编码序列间的间隔序列(内含子)。 实验原理 植物DNA的分离是分子生物学、遗传学和育种学等植物科学研究的基础要求。对DNA提取一般有三个要求： 1. DNA的纯度可以满足下游操作的要求 2. DNA必须完整 3. DNA应当有足够的量 构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。 RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。 如果对植物进行大规模筛选，操作程序应当快捷，简便，价格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂。 核酸的理化性质 RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把蛋白质和糖去除，同时除去RNA及无机离子等，从中分离DNA 。 提取植物DNA的方法主要采用SDS和CTAB法，对它们进行稍加修改就可以应用于DNA的微量提取。两种方法均采用去污剂裂解细胞并保护DNA不受内源核酸内切酶降解。 具体方法简单说来就是利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。 实验材料和试剂 实验材料：新鲜植物组织。 100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 50mmol/L EDTA 500 mmol/L NaCl 1.5% SDS SDS法DNA提取缓冲液 实验所需试剂： 24:1/氯仿:戊醇 其它试剂：液氮、TE缓冲液， 无水乙醇、70%乙醇。 CTAB法DNA提取缓冲液 100mM Tris pH8.0 1.4M NaCl 20 mM EDTA pH8.0 2% CTAB 0.2% 巯基乙醇 酚/氯仿（1:1） 氯仿 无水乙醇 主要试剂的作用： CTAB (十三烷基三甲基溴化铵)/SDS(十二烷基磺酸钠)：阳/阴离子去污剂，与蛋白质和多糖形成复合物，通过有机溶剂抽提去除。 Beta-巯基乙醇：抗氧化剂（保护DNA，去酚） Tris-HCl：缓冲体系，保护DNA EDTA：螯合Mg2＋，抑制Dnase活性 NaCl：高盐体系充分溶解DNP 酚：结合并去除蛋白质，10-15%与水相溶 氯仿：克服酚的缺点，加速酚与水相分层，去处酚 异戊醇：减少蛋白质变性时的气泡，加速分层 实验仪器 实验步骤： 取新鲜叶片约3g, 剪碎, 加入液氮充分研磨后转移至2ml离心管中； 2. 在65℃预热的提取液中按3.8g/L加入Na Bisufite, 混匀并调pH至8.0； 3. 在管中加入适量提取液，60℃水浴保温约30min，不时颠倒混匀； 4. 冷却至室温后加入等体积氯仿/异戊醇，用力摇匀后，放置摇床上摇动15min左右； 5. 室温下10000rpm离心15min，小心吸上清于新的离心管中，加入两倍体积的冷酒精，-20 ℃放置1h或过夜； 6. 挑出DNA置于新的管中，挑出有困难时可以低速离心后倒去上清。加入适量70%酒精，摇动洗涤10min，重复洗涤2-3次； 7. 吹干DNA，加入适量TE在65℃溶解，完全溶解后离心去除杂质； 加入RNase（10mg/mL）, 室温处理0.5-1h, 除去RNA，4℃或-20℃贮存。 如需纯化DNA，再加入适量TE，氯仿/异戊醇多次抽提后吸取上清，加入3ml/L NaAc和两倍体积的乙醇， -20 ℃放置1h或过夜； 吹干沉淀后，加入适量TE， 65℃溶解， 4℃或-20℃贮存。 1.