分子生物学实验：2 实验二 PCR技术.pptVIP

DNA的电泳及PCR分析 实验二 孔忠新 2013.03.05 实验目的： 学习并掌握DNA的电泳原理与技术 学习并通过操作掌握基于DNA的聚合酶链式反应（PCR）基本技术 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳的原理 ? ?? ? 琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D－半乳糖和3,6脱水L－半乳糖连接而成的一种线性多糖。 在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1％－3％，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。 凝胶的EB染色 EB使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。 聚合酶链反应 Polymerase Chain Reaction, PCR “经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 —— Korana于1971年 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给 DNA的体外合成提供以致一种合适的条件： 模板DNA， 寡核苷酸引物， DNA聚合酶， 合适的缓冲体系， DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点； 能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断； 可从一根毛发、一滴血、甚至一个单细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。 PCR技术是分子生物学领域中的一项革命性创举和里程碑。 PCR技术基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 变性--退火--延伸 延伸：模板-引物结合物在Taq聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补链。 变性：加热至93℃左右一定时间后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 退火(复性)：模板DNA变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 Primer F Primer R A G T C PCR扩增DNA原理 图 PCR扩增DNA原理示意图 ①变性（95℃）；②退火；③延伸（72℃） 图 PCR扩增曲线示意图 PCR标准反应体系 DNA模板 0.1～2ug 引物 10～100pmol 反应缓冲液 10ul dNTP 各200umol/L 耐热聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L ddH2O 加至 100ul 0.2kb 0.5kb 0.3kb 0.2kb 0.5kb 0.3kb × 0.2kb 0.3kb 0.5kb 品系1 品系2 品系1 品系2 R R R R R R F F F F F ? M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 147 190 PCR扩增DNA产物电泳结果 PCR反应体系中的问题 引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 模板的量与纯化程度：是PCR成败与否的关键环节之一。 酶及其浓度：催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)。 dNTP的质量与浓度：等摩尔配制，遏制错配率，与Mg2＋的浓度比例。 Mg2+浓度：浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 左图与右图比较，右图中出现的问题： 1. 引物浓度偏高; 2.