分子生物学实验：3 实验三 电泳技术.pptVIP

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 A M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 147 101 100 190 B M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 D C Resistant M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 147 190 101 100 Resistant Susceptible Susceptible Resistant Susceptible Resistant Susceptible 147 101 100 190 147 190 GWM344 核酸电泳指示剂的选择 指示剂： ? ?? ? 核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似。 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有： 1、 增加样 品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 2、 在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置。 3、 使样品呈色，使加样操作更方便。 染色剂： ? ?核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色。 ? ?溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。 可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min。琼脂 糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染 色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察。 　银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，灵敏度比EB高200倍。但银染色后，DNA不宜回收。 主要试剂及相关问题： 1. Acr 和 Bis 比例29：1，一般使用中还会用到19:1和39:1等比例，此时分辨率最佳 ，凝胶成透明；Bis多硬无弹性。避光室温保存，隔几个月重配。 2. SDS 电泳级 10%母液，室温储备。 3. 分离胶、浓缩胶的Tris 缓冲液 分别为PH 6.8 、PH 8.8 神经毒剂！！！ 刺激呼吸系统！！ 4. TEMED (四甲基乙二胺) 通过催化过硫酸铵形成自由基，加速Acr Bis 聚合。低PH聚合反应受到抑制。 5. 过硫酸铵 提供引发聚合反应的自由基。10% 4℃保存， 吸入致命、挥发性强极其易燃，周围不得有明火！！！ 每周新配！！ 脉冲场凝胶电泳pulsed-field gel electrophoresis PFGE 超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（40kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决定于电场强度。但 PEGE 解决了这一问题。 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。 该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。 A- +A B+ -B 脉冲电场电泳示意图 A- +A B- +B 垂直交变电场系统 场翻转系统 箝位匀强电场系统 旋转胶系统 A- +A B- +B A- +A B- +B - + 等电聚焦电泳 Isoelectric Focusing Electrophoresis IEFE 等电聚焦电泳 蛋白质是带有电荷的两性生物大分子，其正负电荷的数量随所处环境酸碱度的变化而变化。在电场存在下的一定pH溶液中，带正电的蛋白分子将向负极移动而带负电的蛋白分子将向正极移动，在某一pH时，蛋白分子在电场