分子生物学实验：4 实验四 细菌转化.pptVIP

试验五 质粒的转化与鉴定 孔忠新 2013.03.26 实验目的 学习掌握质粒转化的原理和一般技术 2. 学习和掌握重组质粒的检测原理与方法 放大某一基因片段，用于探针、基因功能检测、报道基因研究等。 携带目的基因的重组质粒在大肠杆菌中进行表达。 PCR产物的克隆和测序。 构建基因库、cDNA库等。 纯化基因片段 为什么需要质粒转化 实验原理 关于载体——质粒 质粒是一类双链、闭环的DNA分子，存在于细菌体中，独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。通过改造，实验室常用质粒被赋予了以下几种特性： 1．含有多克隆位点区域，可方便地插入目的DNA片段。 2．对细菌的可转移性，即在实验中，可将质粒诱导入细菌。 3．选择标记。常用的有抗生素抗性基因。这样，一旦质粒进入细菌，便可使该细菌对相应的抗生素产生抵抗能力，在含这一抗生素的琼脂平板上传代。 4．在细菌体内可获得较高的拷贝数，例如一种叫pUC的质粒，在单一细菌体中的拷贝数可达500-700个。因此，质粒已成为分子生物学中使用最为广泛的载体。 质粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌，这个过程称转化。 转入的质粒DNA仍能进行复制，产生多个拷贝。 根据实验的需要是否将片段进行表达，将载体分为表达载体和克隆载体。 克隆载体一般是将需要目的DNA片段与载体相连接，导入原核细菌内，使质粒在原核细菌内大量复制，得到大量的重组质粒。 常用的克隆载体有： pGEM-T, pBR322, pUC18/19 表达载体一般是将需要目的DNA片段与载体相连接，导入原核细菌或真核细胞内，使目的DNA片段在菌内或细胞内得到转录与翻译，得到目的蛋白。 常用的表达载体： 原核系统：pET系列，pQE系列，pGEX系列 酵母表达系统：pPIC9，pPIC9k，pPICZ 真核细胞系统：pCMVp-NEO-BAN，pEGFP， CMV4，pEGFT-Actin 实验所用的质粒是pUC19，全长2686个碱基对（bp），在质粒的 10-110 bp段为多克隆位点区域，含有 Pst I、EcoR I、Kpn I、Sma I、Hind III、 BamH I、Sac I等多种限制性内切酶的位点。 实验原理 关于外源DNA片段的获得 特异性DNA片段的PCR扩增 1. PCR扩增出的基因组片段 2. cDNA 化学方法人工合成的DNA片段 实验原理 关于外源DNA片段与载体的连接重组 采用由Hind III切割开的pUC19 质粒，以及由Hind III切割PCR片段，用T4噬菌体DNA连接酶将PCR片段与切割开质粒DNA片段重新连接成一个环状的DNA分子，即把目的基因DNA插入质粒DNA，实现质粒重组。 限制性内切酶（restriction endonuclease）指能识别碱基构成特异的一段（4~8 bp）双链核酸序列，并从中将核酸的磷酸二酯键断裂的一种蛋白酶。 每种酶有特异的识别核酸序列，称为酶切位点，一般为回文序列。 所有的限制性内切酶切割DNA均产生含5′磷酸基和3′羟基基团的末端 。 外源DNA和质粒都是用同样的两个酶切的，然后构建成含有外源基因的质粒 目标DNA 质粒载体 插入外源DNA 实验原理 关于感受态细胞(Competent Cells) 野生型E.coli并不容易转化，这是由于生物自身的免疫机制决定的。细菌可以产生一种酶能迅速降解进入的外源DNA。经过多年的努力，科学家们发现了一种方法可以增加细胞吸收外源DNA的效率。那就是通过化学等特殊方法处理细胞，使其改变膜对DNA的 通透性。这种细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。 重组质粒 重组质粒 野生型E.coli 感受态细胞 CaCl2 低温 短暂热刺激或电击 热激法：大肠杆菌在 0 ℃ CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。 电击法：使用瞬时高压电（数千伏特）处理细胞悬液，微生物细胞膜在高压电的作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的孔洞进入细胞内部。做电击转化时，悬液中有近70%的细胞会因电击而死亡，但是这种方法很直接，转化效率很高。当需要高的转化效率时，比如制作基因文库，可以采用电击转化，另外，做酵母等真核生物转化时一般都是电击。 实验原理 关于质粒转化技术 实验原理 关于重组质粒的筛选与鉴定 实验原理 关于重组质