分子生物学实验：5 实验五 质粒DNA的提取与检测.pptVIP

实验五 质粒DNA的提取与检测 孔忠新 2014.03.24 实验目的 学习掌握质粒DNA提取的原理和一般方法 了解DNA检测的原理和方法 白斑（含重组质粒的阳性菌落） 蓝斑（不含重组质粒的阴性菌落） 挑取阳性菌落 液体培养 质粒DNA提取 实验原理 DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。 SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。 实验原理 方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。碱裂 解法有操作简便、快速、得率高的优点。 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求。 质粒DNA的提取方法 试剂 溶液ＩTris-Cl 25 mmol/L (pH8.0)EDTA 10 mmol/L (pH8.0) RNase A 100 ug/ml 溶液Ⅱ（实验时现场配置）NaOH 0.2 mol/L SDS 1.0% 溶液Ⅲ乙酸钾 3.0 mol/Ｌ 冰乙酸水 碱裂解法基本原理 葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性，避免质粒被酶降解。 NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的变化；但NaOH易和空气中的CO2发生反应，形成碳酸钠，降低了NaOH的碱性，所以必须用新鲜的NaOH。SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS能很好地结合蛋白，产生沉淀。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂。 溶液III中的醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的纳离子而形成了PDS，因为十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。2 M的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和。 70%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase。 将2 mL 含Amp ( 50 μg／mL ）的LB 液体培养基加入到试管中，接入含重组质粒的大肠杆菌，37 ℃ 振荡培养过夜。 取1.5 mL 培养物倒入微量离心管中，1200rpm/min 离心 1 min 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 将细菌沉淀悬浮于100μL 溶液I中，充分混匀。 加150μL 溶液Ⅱ，立即温和颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变的清凉。随后将离心管放置冰上1-2min (时间勿超！) 加150μL溶液Ⅲ，立即温和颠倒离心管数次，将离心管室温放置5 min 。12000rpm离心12min。 加入等体积的异丙醇，充分混匀，10000 rpm离心10 mins（4℃）。 加入70%乙醇充分洗涤，倒出乙醇，吹干，加入30 μL溶解DNA。 1%琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA。 实验步骤 测定DNA浓度的方法主要有两种: 利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值； 第二种方法是测定样品中溴化乙锭（EB）发射的荧光的强度来计算核酸的含量。 另外还有一种用于粗略检测DNA浓度的方法是通过凝胶电泳，与标准分子量相比较。 DNA浓度的测定： 原理： 核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50μg/ml，单链寡核苷酸的含量为30μg/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和28