分子生物学实验：图位克隆：遗传学的经典策略.pptVIP

图位克隆：遗传学的经典策略 孔忠新 2012.05.21 图位克隆的定义： 图位克隆(Map-based cloning) 又称定位克隆(positional cloning)，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA 顺序，无需预先知道其表达产物的有关信息。 用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座，再利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步移逐步逼近目的基因或通过染色体登陆的方法，最终克隆目的基因并通过遗传转化实验可以研究目的基因的功能。 图位克隆的原理： 1. 建立目的基因的遗传分离群体 2. 找到与目的基因紧密连锁的分子标记 3. 用遗传图或物理作图将目的基因定位在染色体特定位置 4. 构建含有大插入片段的基因组文库 5. 以与目的基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库 6. 用阳性克隆构建目的基因区域的重叠群 7. 通过染色体步移或登陆，获得含有目标基因的大片段克隆 8. 通过亚克隆获得目标的小片段克隆 9. 测序获得候选基因碱基序列 10. 通过遗传转化和功能互补验证，最终确定目标基因的功能。 图位克隆的一般流程： 标记1 基因 标记2 标记1 基因 标记2 2 3 4 5 6 BAC重叠群 BAC重叠群 1 2 3 4 5 初步定位 精细定位 6 亲本1 亲本2 X F1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100 gene F2 标记1 基因 标记2 标记1 基因 标记2 2 3 4 5 6 1 2 初步定位 精细定位 2 cM 1.2 cM 0.02 cM 0.01 cM 标记1 基因 标记2 2 BAC重叠群 BAC Clone 基因1 基因2 基因3 基因4 基因5 基因6 基因7 基因1 基因2 基因3 基因4 基因5 基因6 基因7 转基因 突变体 单倍型分析 序列 - 功能 1、需要有精确的遗传图谱； 2、遗传图谱上离目的基因很近的分子标记在物理图谱上还 相距甚远； 3、高等植物基因组极其复杂，存在大量重复序列，在实际操作中会遇到走不动的难题。 图位克隆过程存在的问题：