（Molecular Biology）分子生物学 4.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * DNA热变性从开始到完全解链是在一个相当窄的温度范围内完成的。通常把DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为DNA的解链温度，用Tm表示。 Tm是DNA样品中(G+C)含量的函数，对于长DNA分子，其取值范围是80-100?C。 3)影响Tm值的因素： What parameters affect theTm? a) DNA片段长度及其均一性 % dsDNA b) (G+C)含量。DNA每增加1%的(G+C)含量，Tm值增加大约0.4 ?C。 Tm=69.3+0.41x(G +C)% (G+C)%=2.44x (Tm-69.3) c)介质的离子强度。介质的离子强度低时，Tm值也低，熔解温度范围也宽。 4) 环状DNA的变性： 如果两条链都是闭合环状的, 变性可以打破双螺旋结构，但两条单链相互缠绕在一起，不能分开。 如果其中一条或两条链上有切刻，两条链在热变性时将分开。 4. DNA复性 在一定条件下，变性的DNA的互补碱基对间氢键重新形成，恢复原来的双链状态，称为复性。热变性DNA经缓慢冷却后即可复性，也称为退火。 快速降温： 仅在局部区域发生碱基配对，重新形成双链。光吸收值下降很小。如dsDNA加热变性后将其迅速冷却至4℃以下，则不可能发生复性。比Tm低25℃为DNA复性的最佳条件。 慢速降温： 互补链相互配对，形成完全的双链DNA。光吸收值与原初样品相同。 核酸杂交： 利用复性技术使不同来源的核酸互补序列结合形成双螺旋结构的过程。例：Southern杂交、Northern杂交。 核酸的分子杂交 (hybridization): 加热 双链DNA 单链DNA 杂交 杂合双链 在DNA复性过程中，双链分子的再形成既可以发生在序列完全互补的核酸分子之间，也可以发生在碱基序列部分互补的不同的DNA之间或DNA与RNA之间，这种现象称为分子杂交。 本章重点、难点： 核酸的二级结构：双螺旋模型、加卡夫法则、稳定力； 三级结构：连接数、缠绕数、扭曲数，拓扑异构酶； 理化特性和热力学特性：变性、复性，Tm，DNA纯度 * * * * * * * * * * * * * 一、DNA的二级结构的研究史 ?二十世纪二十年代，Levene研究了核酸的化学结构并提出了四核苷酸假说。他认为DNA分子是由A、G、C、T4 种核苷酸不断重复延伸而成。 ?二十世纪五十年代初，Chargaff采用层析和紫外吸收分析等技术研究了DNA分子的碱基组成，发现不同物种的DNA碱基组成不一样，并总有[A]=[T]；[C]=[G]。 Chargaff用有说服力的数据彻底否定了四核苷酸假说。 ? 1953年，Watson和Crick以Chargaff的发现为基础，进行DNA晶体的X-射线衍射图谱研究，提出了DNA的双螺旋结构。1962年， Watson（美）和 Crick（英）与Wilkins共享Nobel生理医学奖， Wilkins通过对DNA分子的X -射线衍射研究证实了Watson和Crick的DNA模型。 * * * * * * DNA的右手螺旋并不是自然界DNA唯一存在的方式。右手螺旋结构是在生理盐水溶液中提取的DNA的结构，目前将这种结构称为B-DNA。 1979年，Alexander Rich发现了左手螺旋，称为Z-DNA，另外也有A-DNA的存在。 * * * 4. DNA双螺旋结构的类型: 三种形态的DNA：A-DNA, B-DNA, Z-DNA 两类：右手螺旋和左手螺旋 A B Z A B Z Mi Ma Ma Mi Mi Ma 较宽，结构更紧密， 是RNA及RNA与DNA杂合体的主要螺旋形式 单一交替的嘧啶－嘌呤序列 如5’-CGCGCG-3’ 不是体内核酸的主要形式 所有DNA的稳定形式 11 12 10 四、DNA的三级结构－超螺旋 1. DNA 超螺旋 DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。 超螺旋DNA不仅存在于环状DNA中，也存在于线性DNA分子中。 正超螺旋：DNA扭曲的方向与双螺旋方向相同。具正超螺旋的DNA处于过旋状态。(左手超螺旋) 负超螺旋：DNA扭曲的方向与双螺旋方向相反。具负超螺旋的DNA处于欠旋状态。(右手超螺旋) 2. 超螺旋的拓扑学 连接数 Lk (Linking number)： 两条链相互连接的数目。 超螺旋的水平可以用连接数的变化（?Lk）来衡量。刚刚从细胞内分离出来的DNA分子通常是负的超螺旋。约6圈超螺旋/100圈双螺旋（1000 bp），表示为 ?Lk/Lk?= -0.06。 负超螺旋DNA具有比松弛的DNA更高的能量。这