2012年qPCR原理和分析方法.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 样品制备 环境要求 模板准备 数据分析 RT 上机 浓度确定 SYBR法实验流程及注意事项 无RNase环境 使用无RNase耗材 专用RNase-free工具 高纯度，浓度均一的RNA 分光光度计检测 电泳检测 RT 反应体系优化 试剂选择 样品制备 模板准备 数据分析 上机 AMV M-MLV Quant Super 下游反应数确定反转录体积 选择应用引物 高效、全长的cDNA SYBR法实验流程及注意事项 模板准备 引物设计 浓度确定 环境要求 误差控制 RT 样品制备 数据分析 上机 核酸制备区 反应液制备区 制作标准曲线 设定浓度区间 评价引物 使用mix降低系统误差 设置重复（≥3次） 设置空白和阴性对照 均一的反应液和模板混合物 GC％：50－60％ Tm：50－65℃ 单个碱基重复＜4个 无二级结构 扩增长度：100－200bp 反应体系优化 上机 反应条件优化 RT 样品制备 模板准备 数据分析 反应体积＞5ul，推荐20－50ul Mg2＋调节，酶活调节 引物浓度优化，模板量优化 退火温度优化：梯度PCR 延伸时间：产物长度决定 扩增效率：90％－110％ 重复性：std＜0.2 标准曲线：R＞0.99或R2 ＞0.98 SYBR法实验流程及注意事项 标准品 待测样本 阳性对照 阴性对照 技能要求 误差控制 仪器介绍 上机 试剂选择 RT 样品制备 模板准备 数据分析 自配 realmastermix RCHO-Lightcycler series ROTOGEN-RG series BIO-RAD Opticon series ABI-7series Bioer－Linegene series 分装控制 内参控制 机器校正控制 平滑曲线，重复性好，灵敏度高 SYBR法实验流程及注意事项 数据分析 仪器介绍 分析方法 上机 RT 样品制备 模板准备 相对定量：2－△△Ct法 绝对定量：标准曲线法 可靠，准确的数据 SYBR法实验流程及注意事项 内容概要 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法 绝对定量分析方法简介 相对定量分析方法简介 绝对定量简介 标准样品的制备 绝对定量简介 拷贝数的计算 待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数 样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014 倍比梯度稀释方法： 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v 扩增效率（E）：扩增效率与标准曲线的斜率相关：E=10－1/斜率，理论的扩增效率理论值应该为2，即每 一个循环的PCR产物都翻倍，那么2＝10－1/斜率，优化的标准曲线斜率应该为－3.32 E用每个循环扩增模板百分比表示即：E％＝（E－1）×100％ 例如E＝1.95，那么E％＝（1.95－1）×100％，即每次循环有95％模板被扩增 扩增效率概念 绝对定量简介 绝对定量举例：HBV病毒检测 Sample: HBV阳性标准品，分别含有5×103、5×104、5×105、5×106 copies /ml copies/ml Ct1 Ct2 Mean Ct STD 5×103 28.18 28.64 28.41 0.16 5×104 25.25 25.14 25.19 0.04 5×105 22.11 22.46 22.28 0.12 5×106 18.63 18.92 18.77 0.10 BLANK None None 实验数据： 绝对定量简介 标准曲线制作举例 扩增效率（E）计算 E=10-1/斜率 =10-1/-3.17 =2.03 E%=(2.03-1) ×100% =103% 标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线 y = -3.17x + 37.52 R2 = 0.9988 标准曲线制作举例 如未知样本Ct为20.5 标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线 将Ct值带入线性方程： 20.5= -3.1726 X + 37.52 X= 20.5-37.517 -3.1726 =5.36 QuantityUnknown=105.36