中心实验室实验指南双向凝胶电泳.PDF

中心实验室实验指南 双向凝胶电泳 作者：郭丹 修订日期：2014-9-16 【目的及应用】： 双向凝胶电泳 【试剂及设备】： 1.试剂 IPG 胶条水化和一向电泳：7cm/24cmIPG 胶条和胶条槽，覆盖油，水化液储存液(7M 尿素/2M 硫脲 /2%CHAPS/0.5%IPG 缓冲液) ，DTT ，IAA ，蛋白样本(经过蛋白盒纯化 和定量) ； SDS 凝胶配置：30%单体贮存液/4×分离胶缓冲液(pH8.8)/ 10%SDS/TEMED/ ASP 二向电泳：0.5%琼脂糖封顶液/ 电泳缓冲液/蛋白Marker 2. 设备 一向等电聚焦仪Ettan IPGphor ，SDS 电泳仪，脱色摇床 【实验步骤】： 1. IPG 胶条的水化和一向电泳 1.1 IPG胶条槽的准备： 以专用清洗剂浸泡用过的胶条槽，用牙刷清洗后，再分别以水和去离子水冲洗，在空气中 完全干燥后使用。 *不可用含有强酸或强碱的洗涤剂，洗刷时切勿损伤到内外的四个电极。 1.2 样本的水化上样准备： (1) -80℃下取出IPG胶条,室温下复融30min左右； (2) 根据实验需求(IPG胶条长度和数目等)取出水化液储存液(-20 ℃，不可反复冻融) ，每500μl 水化液加入1.4mgDTT并充分混匀； 编号 ：PUMCHCL-P-3-Q02-1 北京协和医院中心实验室 更新日期：2014/09/1 1 第1 页,共6 页 中心实验室实验指南 (3) 由蛋白浓度计算水化上样的体积，以24cm IPG 胶条为例,控制蛋白上样量在银染时为 45~100μg，考染时为200~1300μg(1mg左右) ； (4) 蛋白样本 水化液储存液(1.4mgDTT/500μl) 溴酚兰储存液(1~2μl) 总体积 450μl 1.3 水化上样的操作步骤 (1) 吸取样本水化液,沿胶条槽水平匀速加入,尽量使水化液均匀分布； (2) 从酸性端(标“ ＋”端)一侧剥去IPG 胶条的保护膜，胶面朝下，先将IPG胶条阳极端朝胶条槽 的尖端方向放入，利用胶条和水化液之间的亲和力慢慢下压胶条，以避免生成气泡，最后 放下IPG 胶条平端(阴极) ，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极 接触。同时可以用枪头吸取水化液较多的填补至较少的地方,使水化液均匀分布。 *一定要确保胶条下方无任何气泡，否则将严重影响一向聚焦。若已产生气泡，可用小镊子 轻压胶条背面，使气泡排出，并尽量使胶上的气泡位于胶条两极。 (3) IPG胶条上覆盖适量(2~3ml左右) Immobiline DryStrip 覆盖油，盖上盖子； (4) 在将胶条放置到IPGphor 电泳平台前，必须先用水平仪将仪器调平，保证胶条是在水平状态 下进行等电聚焦的； (6) 设定一向聚焦的条件如下： 温度 20°C 最大电流 50μA / IPG strip 样品体积 450µl (24cm IPG strip) 电压 时间 Step 50 V 10-12 hours(过夜水化) Step 200 V 1 hour Step 500 V 1 hour Grd 2000 V 1 hour Grd 5000 V 1 hour 编号 ：PUMCHCL-P-3-Q02-1 北京协和医院中心实验室 更新日期：2014/09/1 1 第2 页,共6 页 中心实验室实验指南 Grd