临床PCR实验攻略.docx

临床PCR实验攻略? 基础篇一、如何选择试剂，评价试剂是否符合自己实验室条件？现在临床PCR实验室使用的试剂大部分都是各生产企业提供的商品化的试剂盒，那么试剂质量的好坏直接决定了实验结果的好坏，而不同厂家试剂的性能、质量和价格千差万别，如何选择一款合适的试剂对每个PCR实验室都至关重要，一般来说，选择试剂主要从以下几个方面进行评价：1、重复性首先，试剂检测结果的重复性直接展现了试剂的方法学及其质量的好坏，是评价试剂好坏最明显、最直接的指标。其次，我们在此说的试剂重复性是指对原始样本检测的重复性，而不是对某一个样本提取的核酸进行重复性的检测和评价。最后，试剂的重复性对于疗效检测、用药指导有着重大的意义，一个重复性好的试剂，往往能够在病人的抗病毒治疗过程中，给医生和病人提供最直接、最可靠的数据，让医生和病人对疾病进展有更清楚的认识，从而制定合理的治疗方案，实现更好的治疗效果。2、灵敏度一个试剂的灵敏度往往能够体现该试剂的技术水平和先进程度，同时对于临床病症的监测有着举足轻重的意义。以乙肝为例来说，我国的乙肝复发率远远大于发达国家，同时由乙肝病毒感染转换为慢性肝炎、肝硬化、肝癌的患者也居世界前列，这很大程度上与对低载量病毒监控的严重不足有关。美国肝病学会专家组就提出，对乙肝抗病毒治疗过程中，HBV DNA的最低监测点应设置为10IU/ml，而欧洲和亚太肝病学也指出HBV DNA病毒载量应该尽可能小于10IU/ml。这都足以证明，高灵敏度对于用药治疗、病程监控等起着巨大的作用，灵敏度越高，对于疾病的监控效果更好，对于确定治疗的终点，具有积极的指导作用。3、定量准确性对于临床检测中定量项目来说，试剂盒定量的准确性是非常重要的，也是评价定量试剂盒的一个重要指标之一。卫生部每年都会有2次全国性的室间质评，通过质评结果可以很好的看出试剂盒定量的准确性。但往往很多时候，实验室在选择试剂的时候都偏重与过去的试剂盒比较定量结果的差异，并以过去的试剂盒定值作为标准来参考和评价一种新试剂，其实这种方法不完全可取。不过可以通过同时检测卫生部的质控品来进行比较，这样才使得两种试剂在同一客观标准上进行PK，得到合理公平的评价。同时，要验证一个试剂的定量是否准确，我们可以采用一个高浓度样本，用阴性血清依次进行10倍梯度的稀释，然后选取多家试剂公司的产品进行同步检测PK，考察各公司试剂对样本定值的实际值与理论值的差异，即可判断各公司试剂定量准确与否。4、有无内标监测内标的一个最主要的作用就是控制假阴性结果的发生，但在国内临床检测中往往被忽视了，这主要与两个方面有关，一个是之前国内使用的很多荧光定量PCR仪均为单通道的仪器，无法进行多色荧光的检测；国内外PCR行业对内标的研究已不是一个新兴课题，目前国内PCR行业能把内标做得非常好的科研单位或商业化的PCR试剂厂家寥寥无几，这正体现了这一技术的难度。在临床检测中，内标的作用非常重要。在临床检测过程中，怎么做到每一个阴性结果均为真正的阴性结果，从而杜绝因扩增抑制而出现的假阴性结果呢？内标的加入就能够很好的防止假阴性结果了，加入我们做了一个样本，它的目标检测荧光为阴性，内标检测荧光也为阴性，那么这个样本的扩增则受到了抑制，该阴性结果为假阴性，我们必须对该样本进行复检。如果试剂没有内标的话，我们则不能很好的判断该结果是否正常？是否可以发报告？在发报告时，我们无法保证发出去的结果百分之百的准确；内标的加入，就可以解决我们这方面的烦恼。目前，卫生部的专家也在大力推崇内标的重要性，也是为了保证检验结果的准确可靠。 5、线性定量范围试剂盒的线性定量范围指的是试剂盒最低检测下限和最高检测上限之间的范围，范围越宽说明试剂盒性能越好。 6、UNG酶防污染体系PCR反应过程中， 1个拷贝的DNA经过30个循环后，可以增长到10亿个拷贝的产物DNA， 极微量的PCR 产物污染，就可能造成假阳性，因而这是一个值得特别重视的问题。尿嘧啶糖苷酶（UNG）法：将PCR 产物中的dT用dU 代替。这种dU 化的PCR 产物与UNG 一起孵育，因UNG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG 对不含dU 的模板无任何影响，UNG 可从单或双链DNA 中消除尿嘧啶，而对RNA 中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。此外，试剂的稳定性、批间差、溯源性（是否溯源于WHO国际标准品）等也都是考察一款试剂盒质量重要指标。二、如何选择荧光定量PCR仪器？1、仪器使用的广泛程度如果不是一个新出现的仪器品牌，为保证所购置的仪器有充分的可靠性，临床PCR实验室可以从相应仪器在国内外使用的广泛程度来判断。应用越是广泛的仪器，越是经过实践验证的，也就越具有可靠性。2、仪器的检测通量（反应孔