细菌内毒素检查法(凝胶法).ppt

细菌内毒素检测之凝胶法 实验程序 1、试验准备：试剂、仪器及用具 2、内毒素限值的确定 3、确定最大有效稀释倍数 4、凝胶限度试验 5、结果判定 要求 1、以最终产品为检测必要 （浓度超过0.5mg/ml） 2、检测样品PH应在6~8之间，不符应调整 2、内毒素限值的确定 L=K/M 式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示。一般由供试品提供者直接提供内毒素限值如1000EU。 3、确定最大有效稀释倍数 （MVD）： MVD=cL/λ 式中L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度；λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)。 3、鲎试剂灵敏度复核 按下表制备溶液A、B、C，使用稀释倍数为MVD的供试品溶液来制备溶液A，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 6、结果判定 将制备好的试剂用锡箔纸包裹好后放入电热恒温水浴锅中， 37℃恒温水浴60min后观察结果（保证玻璃瓶中溶液处于水面以下，并防止水进入瓶中）。若阴性对照溶液B为阴性，阳性对照溶液C为阳性，试验有效。 若溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定；若溶液A的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试，复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定；否则判定供试品不符合规定 操作注意事项 试验前准备： 1、玻璃器具应规范化，便于除热原、计量准确、清洗操作方便。 2、用于内毒素检测的稀释试管最好用玻璃试管；塑料用具只能为一次性且保证无内毒素。 实验环境：最好在洁净室或洁净工作台内进行，保证环境温度、湿度及通风稳定。 实验人员：戴干净手套和口罩。 实验过程： 1、内毒素工作标准品应严格按要求低温保存；工作标准品开封后尽快使用且应一次性用完，不再保存。 2、每一步稀释液所用的移液器不能反复、交叉使用。 3、鲎试剂复溶时应将检查用水顺着瓶壁加入，避免产生气泡。 4、操作时间的长短。环境温度变化都会影响实验结果，故操作应尽量熟练、快速。 5、恒温器的温度变化应1℃，鲎试剂与样品混匀后应立即移入水浴槽，严格控制保温时间在60±2min，保温期间不得移动试管架，桌面保持平稳，周围不能有振颤因素。 结果判断：恒温结束后，取出试管或反应瓶缓缓倒转180°，不从管壁脱落为阳性，不能保持完整即使有部分脱落者也判为阴性。 * * 细菌内毒素检查（凝胶法） 细菌内毒素检查法 凝胶法 方法分类 浊度法 光度法 显色基质法 重现性好 方法特性 能定量 能控制药物的增强/抑制干扰 操作简便。节省时间 原理： 利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关. 1、试验准备：试剂、仪器及用具 仪器与器具 电热恒温水浴锅、定时钟、去热源枪头和小玻璃瓶、移液枪、试管架、剪刀、锡箔纸。 试剂 细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素检查用水、鲎试剂。 100ul 100ul 供试品 100ul 标准品 100ul 100ul 100ul 200ul 鲎试剂 A A C B *