第八章_园艺植物基因的分离与克隆精要.ppt

一、基因芯片的原理 （一）基因芯片的原理 将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后使其与待测的标记样品基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。 （二）cDNA微阵列芯片 将克隆到的成千上万个基因的特异探针或所构建的cDNA文库内的cDNA片段固定在一块DNA芯片上。 对来源于不同的个体、组织、发育阶段、或诱导处理条件下差异表达的mRNA反转录为cDNA进行检测，找出差异表达的序列。 以差异序列设计探针即可从文库中筛出相应的克隆，经测序鉴定就可以确定是否为新基因。 二、基本程序 DNA阵列的构建和印制 根据研究目的选用合适的寡核苷酸、cDNA片段或特定的功能基因，构建点阵列。 将所需的核酸片段原位合成于芯片上，或以大致相当的浓度，按一定的排列方式点样在特定的固相支持物(如玻片、硅片、尼龙膜等)上。 靶（待测）样品的准备 包括DNA或mRNA的分离、纯化、扩增及标记。 标记的方法：在扩增的底物中加入荧光标记的寡核苷酸单体，如用Cys3和Cys5标记的dUTP。 分子杂交和检测 将标记好的样品与芯片进行分子杂交，反应结束后将洗去未杂交上的样品，用激光共聚焦显微镜检测。 基因芯片上每一点对芯片表面各个点荧光信号的强弱进行定量分析，从而对结果进行判断。 基因芯片数据的收集和分析 图像的平滑处理。 图像背景的确定。 样品斑点的识别。 数据的提取、存贮与显示。 Microarray Expression Analysis AAAAAAAA AAAAAAAA Sample A Sample B TTTTTTTTT TTTTTTTTT Cy5-labeled nucleotides Cy3-labeled nucleotides Mixing, hybridization detection Green: sample B Red: sample A Yellow: mixture Black: no hybridization A ~40,000 Probe spotted Oligo Microarray 三、优缺点 优点 具有高度的敏感性和特异性，它可以监测几个至几千个mRNA拷贝的转录情况。 具有高信息量、快速、样品用量少、用途广泛等优点，已经被广泛应用到基因差异表达的研究中。 缺点 需要大量已知DNA和cDNA片段的准确序列信息。 需要高密度芯片制作的精密机械系统和操作工艺及微弱的杂交信号检出装置，芯片制作和使用成本较高。 电子克隆 in silico cloning 借助于电子计算机，利用公布的核酸序列资料，进行序列的拼接和组装最终获得完整基因序列的技术，类似于cDNA文库的筛选但更加方便和快速。 思考题 1.什么是基因组文库？简述构建大片段基因组文库的主要步骤。 2.简述合成cDNA第二链的主要方法。 3.简述图位克隆技术的原理及其优缺点。 4.简述转座子标签法的基本步骤及其优缺点。 5.差异表达基因分离法主要包括哪几种方法？各有何优缺点？ 6.简述基于同源序列的候选基因法分离目的基因的主要方法。 7.简述RACE技术的基本原理及其优缺点。 8.简述基因芯片技术的基本原理及其优缺点。 用碱处理mRNA：cDNA杂交体，水解mRNA模板，cDNA第一链3’端能够形成发夹结构，这种结构可用作合成cDNA第二链的引物。在大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段或反转录酶的作用下，利用四种dNTP完成双链cDNA的合成 * 后一类型的衔接头即是：一端为限制酶粘性末端的双链DNA片段，所以如果添加此类有粘性末端的衔接头时，就可以特异性识别，不必再继续进行修饰（即添加衔接头）。 效价测定：生物制品活性（数量）高低的标志，通常采用生物学方法测定。噬菌体效价，又称噬菌斑形成单位（pfu）数,指每毫升试样中含有侵染性噬菌体的粒子数。测定方法有双层平板法。 外显子捕捉技术：外显子捕捉(exontrapping)是构建一种载体，从其插入片段中识别和回收外显子序列，从而克隆目的基因。捕捉外显子的载体pETV—SD是一种反转录病毒穿梭载体(shuttlevector)，即可在不同种生物中如大肠杆菌和酵母，细菌和哺乳动物细胞等进行复制的载体(见图5—14)。因为凡是有内含子和外显子的基因在转录后都要经过RNA剪接，这就需要有剪接供体(splicingdonor，SD)位点和剪接受体(splicingacceptor，SA)位点。因此，SA位点可作为基因的标志。pETV—咀载体的克隆位点上游有一个“外显子捕捉序列” 克隆：目的基因与载体连接及后续的转化过程称